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1、GB/T - 5 8 保质期 固体制剂和液体制剂在25以下，保质期不少于12个月。企业应按上述要求具体标示。保质期内实 测酶活力不应低于标示酶活力。 注：保质期外的酶仍具有使用价值，使用时应重新测定酶活力。 GB/T - 6 附录A (规范性附录) 碱性蛋白酶酶活力的测定 福林法（仲裁法） A.A.l l 原理原理 蛋白酶在一定的温度与 pH 条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸(如: 酪氨酸、 色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂 (Folin) 还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计于波长 680nm 下测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成比例，由此可以计算产品的酶活力。 A.2 A.2
2、 仪器和设备仪器和设备 A.2.1 分析天平，感量0.0001g A.2.2 紫外-可见分光光度计 A.2.3 磁力加热搅拌器 A.2.4 pH计：精度为0.01pH单位 A.2.5 磁力搅拌子 A.2.6 刻度吸管：1mL，2mL，5mL，10mL。 A.2.7 离心机 A.2.8 恒温水浴锅：精度0.2 A.2.9 移液器 A.3 A.3 试剂和溶液试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 A.3.1 福林 (Folin) 试剂（1mol/L） 于2000mL磨口回流装置中加人钨酸钠(Na2WO42H2O)100g、钼酸钠（Na2MoO42H2O
3、)25.0g、水 700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL。小火沸腾回流10h。取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂 (Li2S04)50g、水50mL和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水， 再煮沸除去过量的溴) ，冷却，加水定容至1000mL。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕 色瓶内。 A.3.2 福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。也可使用市售福林溶液配制。 A.3.3 碳酸钠溶液 (42.4g/L) 称取无水碳酸钠(Na2C03)42.4g，用水溶解并定容至1000mL。 A.3.4 三氯乙酸 (65.4g/L) 称
4、取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。 A.3.5 氢氧化钠溶液 (0.5mol/L) 称取氢氧化钠片剂 20.0g ，加水900mL并搅拌溶解。待溶液到室温后续水定容至1000 mL ， 搅拌均匀。 A.3.6 盐酸溶液：c(HCL)=1mol/L及 0.1mol/L 按 GB/T 601配制。 A.3.7 硼酸缓冲溶液(pH=10.5)，缓冲溶液配制时需用 pH 计测定并调整 pH 值 称硼酸钠9.54g，氢氧化钠1.60g，加水900mL，搅拌至均匀。用1mol/L 盐酸溶液或 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液（A.3.5)调整pH=10.5士0.05，定容至1000mL。
5、 GB/T - 7 A.3.8 酪蛋白溶液(10.0g/L) 称取标准酪蛋白 (NICPBP 国家药品标准物质)1.000g，精确到O.001g,加入相应的缓冲溶液约 80mL,再加入磁力搅拌子，在磁力搅拌器上搅拌至均匀、无较大颗粒后，打开加热功能缓慢加热至 酪蛋白全部溶解，注意加热时间以免煮沸导致蛋白变性，冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用缓 冲溶液稀释定容。定容前检查并调整pH值至10.5。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。使用前 重新确认并调整pH值至10.5。 不同来源或批号的酪蛋白对试验结果有影响。如使用不同的酪蛋白作为底物，使用前应与以 上标准酪蛋白进行结果比对。 A.3.9
6、L-酪氨酸标准储备溶液(100g/mL) 精确称取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸O.1000g士0.0002g，用1mol/L盐酸溶 (A.3.6)60mL,溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。 吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL,用0.1mol/L盐酸溶液（A.3.6）定容至100mL，即得到100 g/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。 A.4A.4 分析步骤分析步骤 A.4.1 标准曲线的绘制 a) L-酪氨酸标准溶液:按表A.1，用移液管精密量取配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即 进行测定。 表 A.1 L-酪氨酸标准溶液 管号 酪氨酸标准溶液的浓 度/（g/m
7、L） 酪氨酸标准储备溶液 （A.3.9）的体积/mL 加水的体积/mL 0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 b) 分别取上述溶液各1.00 mL(须做平行试验)，各加碳酸钠溶液（B.3.3）5.00mL、福林试 剂使用溶液(A.3.2)1.00 mL，振荡均匀，置于400.2水浴中显色20min，取出，用分光光度 计于波长680nm,10mm比色血，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵 坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。 C） 利用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(g)，即为吸光
8、常数K值。其K值应 在95100范围内。如不符合，需重新配制试剂，进行试验。 A.4.2 样品的测定 A.4.2.1 待测酶液的制备 精密量取酶样品1mL。用缓冲液溶解稀释到一定浓度并记录其稀释倍数。 对于固体状的样品，精密称取酶样品1g，精确至0.0002g。然后加入一定的缓冲液溶解并记录 克重量，用保鲜膜密封，于磁力搅拌器上搅拌15min以上，滤纸过滤或于离心机（4000rpm， 5min）离心后备用。 推荐浓度范围为酶活力10U/mL15U/mL。 A.4.2.2 测定 a) 先将酪蛋白溶液（A.3.9）放入402恒温水浴中，预热5min。 b) 取四支试管（一支空白管，三支样品管）。
9、GB/T - 8 c) 分别向四支试管中，准确加入稀释好的待测酶液1mL,于402恒温水浴中，预热2min。 d) 然后于空白管中加入三氯乙酸2mL（A.3.4），再于样品管中准确加入酪蛋白溶液1mL （A.3.9），摇匀准确计时10min后，立即向样品管中补加三氯乙酸2mL（A.3.4）；于空白 管中准确加入酪蛋白溶液1mL（A.3.9）。 e) 将四支试管取出摇匀后分别用慢速定性滤纸过滤备用。 f) 准确吸取以上滤液1mL分别置于另外四支试管中，再于四支试管中分别依次加入碳酸钠溶液 5mL（A.3.3）后加入福林试剂使用溶液1mL（A.3.2），摇匀立即置于402恒温水浴中 显色20min
10、，取出备用。 g) 于680nm波长处，用10mm比色皿分别测定其吸光度。 A.4.3 计算 从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为U/mL。样品的酶活力按式（A.1）计算： 2= X34n1 10 （A.1） 式中： X2样品的酶活力，U/mL或U/g； X3由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力，U/mL； 4反应试剂的总体积，单位为毫升（mL）； n1样品的稀释倍数； 10反应时间10min。 所得结果表示至整数。 A.5 A.5 精密度精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过平均值的3%。 GB/T - 9 附录B (规范性附录) 碱性蛋白酶活力的测定 紫外
11、分光光度法 B B.l.l 原理原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下， 水解酪素酪蛋白生成酪氨酸， 然后加入三氯乙酸终止酶反应， 并沉淀未水解的酪蛋白，滤液中的酪氨酸对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法于275nm下测定。 根据吸光度与酶活力的比例关系计算其酶活力。 不同的蛋白酶制剂其紫外法结果与福林法结果的换算系数不同， 参考比值为紫外法相对于福林 法的1.501.80倍左右。如需要，相关方可根据实验结果统计，确定两个方法的换算系数。 B B. .2 2 仪器仪器和设备和设备 同A.2 B B. .3 3 试剂和溶液试剂和溶液 同A.3 B B. .4 4 分析步骤分析步骤 B.4.1 求K值
12、 按福林法的表A.1配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸 光度（A）,并计算K值。K值应在130-135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行试验。 B.4.2 待测酶液的制备 同A.4.2.1.样品稀释液最终的浓度应该在15U/mL25U/mL范围内。 B.4.3 测定 操作同A.4.2.2中的取液、反应、静止沉淀，其中三氯乙酸取样量改为5mL，直至过滤。滤液用紫外 分光光度计，在275nm波长下，测定其吸光度。 注：如结果不平行，可以考虑将加入三氯乙酸的试样溶液返回到水浴中保温30min,然后再测定吸光度。 B B. .5 5 计算计算 从标准曲线上读出样品
13、最终稀释液的酶活力，单位为U/mL。样品的酶活力按式（B.1）计算： 4= 527 10 （B.1） 式中： X4样品的酶活力， U/mL或U/g； X5由标准曲线得出的样品最终稀释液的酶活力，U/mL； n2稀释倍数； 7反应试剂的总体积，单位为毫升（mL）； 10反应时间10min。 结果保留至整数位。 B.6 B.6 精密度精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过平均值的3%。 GB/T - 10 附录C （规范性附录） 粒度的测定 筛分法 C C.1 .1 方法概要方法概要 用规定孔径的标准试验筛，经振筛机筛分，测定筛子及底盘中试样的质量，计算其占式样总质量的 百
14、分数。 C C.2.2 分析分析仪器仪器 C.2.1 标准试验筛，符合GB/T 6005和GB/T 6003.1的规定。按产品标准的要求选取孔径150m的筛子， 配以底盘和筛盖。 C.2.2 天平，感量0.1g。 C.2.3 振筛机，采用拍击式电动振筛机，筛体的运动方式为平行往复式，筛体振幅为30mm10mm，振动 频率为278次/min10次/min，拍击次数为150次/min10次/min。 C C.3.3 试验步骤试验步骤 把按要求选取的清洁、干燥的100目筛子置于底盘之上，一起装在电动振筛机上。称取试样100.0g， 置于上层筛中，加筛盖。开启电动振筛机，振筛5min30s。停止振荡后取下底盘和筛子，收集筛子及 底盘中的试样质量。 C C.4.4 结果计算结果计算 产品的粒度Pi以百分数表示，按公式（C.1）计算： i= 100% (C.1) 式中： mi底筛上留存样品质量，单位为克(g)； m试样的质量，单位为克(g)。 用两次平行测定结果的算术平均值表示，保留小数点后一位。 C C.5.5 精密度精密度 试样过筛的总质量损失不得超过1%。 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不高于1.5%。
