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1、慢性乙肝致炎的细胞分子机制孙琳 毕惠娟 王健摘要：慢性乙肝是一种由HBV介导的以肝脏局部多种炎性细胞浸润的慢性感染性疾病。HBV侵入机体后能否形成慢性感染与病毒是否变异、宿主抗病毒免疫应答强弱等因素密切相关。免疫耐受、Th1/Th2失衡、HBV肝外PBMC感染等是导致乙肝持续感染迁延难愈的重要原因。机体对在清除侵入的病毒时，可对受感染的肝细胞产生一定程度损伤，如CTL通过分泌穿孔素和表达Fasl等途径诱导靶细胞凋亡；肝脏中嗜中性粒细胞和单核巨噬细胞通过产生反应氧（ROS）、一氧化氮（NO）等反应氮等中间产物，介导损伤受感染的肝细胞，在局部形成以单核/巨噬细胞浸润为主炎性损伤和炎性反应。关键词：
2、慢性乙肝；致炎；分子；机制 慢性乙肝是一种由HBV感染引起的以局部单核细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等炎症细胞的浸润为主的感染性疾病。全球约慢性乙肝约有3.54亿，其中，我国约有3000万。HBV侵入机体后，一方面，在宿主细胞内复制增殖，产生大量病毒抗原，诱导机体产生大量的调节性T细胞，对全身免疫系统造成很大压力，致使机体免疫功能低下。另一方面HBV作为一种抗原，诱导机体的细胞免疫反应对其产生免疫清除，此过程可引起部分肝细胞损伤，介导局部炎症细胞浸润，机体为保护肝细胞不受过度损伤，肝细胞自身可表达一些免疫抑制分子，通过与相应的受体或配体结合，形成免疫抑制途径，抑制宿主的抗病毒免疫应答，使病毒持续复
3、制增殖，病程慢性化。本文围绕国内外慢性乙肝致炎的细胞分子机制研究进展进行综述。1. HBV的结构 HBV是一种部分环化的双股DNA，由一条较长且固定的负链(3200bp)和一条较短长度不定的正链(400-1900bp)组成，两链的5末端有长达250300个互补的碱基，通过碱基配对构成部分环化的双股DNA结构。1970年Danes通过电镜从澳大利亚土著人血液中发现了完整的乙肝病毒颗粒，2009年Kamili等1以免疫电镜观察用抗-HBs的多克隆抗体处理样品，发现还存在22nm丝状的亚病毒颗粒；1979年Galibert等将HBV-DNA负链划分为4个开放读码框(open reading fram
4、e, ORF)，其总长为4.7kb，分别为S、C、P、X区。S-ORF长度为1185bp，有S、Pre-S1和Pre-S2 3个功能区，编码外膜蛋白。S区定位于nt155-833，由678个核苷酸组成，编码226个氨基酸的S蛋白，主要是小蛋白（Small protein, SP）或表面抗原，即HBsAg，是HBV疫苗研制的靶点。Pre-S1基因长度不定，定位于nt2848-3204，编码119个氨基酸残基，是HBV与肝细胞膜直接结合位点2。董菁等3应用长距离精确PCR技术（LA-PCR）研究发现在Pre-S1区之前还存在一个ORF，暂命名为前-前-S ORF，长度135bp，编码45个氨基酸。
5、Pre-S2 基因长度固定，定位于nt3205-154，编码55个氨基酸外膜蛋白，具有很强的免疫原性，其120145位氨基酸残基是HBV的重要免疫原性决定区，可诱导中和抗体的产生，研究证实Pre-S2蛋白含有聚合人血清白蛋白（PHSA）受体，肝细胞表面也存在PHSA-R，这样HBV颗粒可通过PHSA与肝细胞膜结合，从而介导HBV入侵肝细胞，成为HBV侵入肝细胞的主要途径4。C-ORF分为C区和前C区，分别编码183-185个氨基酸的多肽即HBcAg、29个氨基酸的残基和核衣壳蛋白HBeAg。HBcAg和HBeAg是由同一基因编码，序列大部分相同，都是抗病毒免疫的重要靶位。前C区极易发生突变，可
6、造成HBeAg的分泌水平下降或终止。P区是HBV DNA序列中最长的ORF，与S、C、X基因均有重叠，编码P蛋白，是病毒复制的主要功能单位。P区包括4个编码区域，从氨基端开始分别为：末端蛋白区(TP)，逆转录过程中与负链DNA5端结合，引导HBV负链的合成。间隔区( SD)，该区耐受突变。逆转录酶区(RT)，该蛋白同时具有依赖RNA的RNA聚合酶活性和依赖RNA的DNA聚合酶活性。核糖核酸酶(RNase) H区，它可裂解逆转录过程中形成的RNA-DNA杂交体中的RNA。X区位于C区的上游，是病毒基因中最小的ORF，其编码含145154个氨基酸的蛋白质HBx。Yang等5对研究发现在HBV基因组
7、中存在Pre X基因，将HBV基因通过PCR法扩增并转载至质粒中进行克隆全基因组序列分析，发现60%的HBV基因编译Pre-X蛋白，Pre-X蛋白可通过反式激活病毒增强子促进HBV的复制，HBx还可激活DNA合成从而促进静止的成纤维细胞增殖。2. HBV的复制 HBV病毒通过特异性受体结合至宿主细胞膜后，通过吞饮或融合的方式穿入细胞膜，脱去蛋白质衣壳，将病毒DNA基因组释放入细胞核，在细胞DNA聚合酶和RNA聚合酶的作用下形成共价闭合环状DNA（covalent closed circular DNA, cccDNA），其作为HBV复制的原始模板，转录成为各种不同分子量的mRNA，主要有3.5
8、Kb mRNA、2.4Kb mRNA、2.1KbmRNA及0.7Kb mRNA（Fig2）。3.5Kb mRNA称为HBV前基因组，它可以作为HBV DNA的模板，由P蛋白逆转录成全长的HBV DNA负链，病毒以新合成的负链DNA为模板，自DR区开始复制互补的正链DNA，两者结合成不完全环状双链DNA即HBVrcDNA。新基金项目：安徽省自然科学基金（No:090413138），安徽省教育厅自然基金重点项目（No:KJ2009A032、KJ2007A019）作者单位：安徽理工大学医学院妇产科护理学教研室 淮南 232001作者简介：孙琳（1964-），女，副主任医师，发表论文10余篇，获市级科
9、技进步奖1项。研究方向：HBV垂直传播与免疫。通讯作者：王健（1962-），男，教授，硕士生导师。E-mail：合成的HBVrcDNA一方面进入细胞核内转化成新的cccDNA，补充细胞内的cccDNA库；另一方面与病毒蛋白装配成新的完整的HBV，释放至胞外。上述二个转录过程均须依赖HBV DNA多聚酶的催化。3.5Kb mRNA的另一种功能是可以表达HBeAg、HBcAg和DNA多聚酶；2.4Kb mRNA可以表达HBsAg和前S蛋白（包括前S1和前S2蛋白）；2.1Kb mRNA可以表达HBsAg。0.7Kb mRNA可表达X蛋白。3. HBV感染后机体的免疫反应 HBV特异性细胞毒性T细胞
10、在控制HBV感染及其清除过程中起着重要作用。机体感染HBV后，首先被抗原提呈细胞（antigen-presenting cell, APC）摄取，在APC胞内降解成免疫原性多肽，与MHC分子结合，经高尔基体转运到APC表面。CD4+T细胞识别抗原提呈细胞上经加工的HBV病毒抗原肽-MHC-类复合物，CD8+T细胞则识别病毒抗原肽-MHC-类分子复合物；TCR与APC表面的抗原肽-MHC分子复合物结合并交联，使与受体相连的激酶如Fyn活化，导致CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM）发生
11、磷酸化，酪氨酸激酶ZAP-70结合到已磷酸化的ITAMs上。CD4携带的p56Lck再促使ZAP-70磷酸化而活化。一方面，活化的ZAP-70使接头蛋白（LAT, SLP-76）磷酸化，它们与含有SH2结构域的磷脂酶C-（phospholipase C-, PLC-）结合，使之活化，并裂解细胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol bisphosphate, PIP2）产生三磷酸肌醇（inositol triphosphate, IP3）和甘油二酯（diacylglycerol, DAG）。IP3可激活膜离子通道，使Ca2+流入胞内，并开放胞内的钙储备，释放Ca2+，
12、胞浆内Ca2+浓度升高可活化钙调磷酸酶（calcineurin），进而使转录因子NFAT（nuclear factor of activated T cell）去磷酸根，由胞浆转移至核内；DAG在胞膜内面结合并活化蛋白激酶C（protein kinase C, PKC），使IB与NF-B（nuclear factor-B）解离，转录因子NF-B转位至核内，将活化信号传至核内。另一方面，活化的ZAP-70可经Ras活化丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）级联反应，将活化信号传至核内，从而调控效应T细胞的增殖及分化来发挥其抗病毒作用。
13、CTL在HBV感染的免疫过程中，识别肝细胞表面的靶抗原，通过产生穿孔素及表达FasL诱导靶细胞凋亡。另一方面，CTL还可以产生细胞因子IFN-和TNF-，降解HBV RNA，从而抑制HBV病毒在肝内的复制。近来有研究表明，由细胞因子介导的非溶细胞性抗病毒清除机制也发挥了重要作用6。非细胞溶解清除HBV的本质是通过多种细胞因子介导的清除细胞内HBV转录模板cccDNA和HBV复制中间产物的过程。特异性CTL和非特异性免疫细胞共同的作用在乙肝急性早期非溶细胞性病毒清除中起着重要作用。它们通过产生效应细胞因子发挥清除HBV作用，IFN-/通过诱导细胞产生抗病毒蛋白来发挥抗病毒功能。IFN-还可诱导组
14、织通过自分泌或旁分泌的形式产生一氧化氮（NO）来发挥抗病毒作用。NKT细胞和专职APC细胞主要是通过产生IFN-/发挥抗病毒效应；CD8+T细胞则主要是通过产生IFN-发挥抗病毒效应，这种非溶细胞作用避免了免疫所介导的大量细胞的破坏，从而保存重要器官功能的完整性。 肝脏是一个富含免疫细胞的脏器。HBV感染肝细胞后，受感染的肝细胞可以迅速识别病毒双股RNA（dsRNA），分泌干扰素/（IFN-/），后者诱导细胞合成抗病毒蛋白，抑制抗病毒蛋白质的合成。IFN-/、IFN-可有效地趋化并激活巨噬细胞、NK细胞、树突细胞、NKT细胞等天然免疫细胞，Webster等7发现NKT细胞在人体感染HBV后出现
15、临床症状之前已有大量聚集，发挥细胞免疫效应功能，抵抗HBV感染。4. HBV慢性感染的细胞分子机制 HBV侵入机体后，形成慢性感染与宿主抗病毒免疫应答强弱密切相关。当机体的免疫系统能够完全清除病毒，即可痊愈，当免疫系统未发育成熟或者机体免疫低下，不能彻底清除病毒，使机体HBV感染慢性化。近年来研究证实，免疫耐受、辅助细胞Th1/2的失衡、高HBV DNA血症以及乙型肝炎病毒的变异在HBV感染的慢性化过程中起重要作用。4.1 免疫耐受机制 免疫耐受（immune tolerance）是一种机体对抗原刺激表现为特异性的“免疫不应答”现象。许多研究表明，免疫耐受是HBV感染慢性化最主要的机制。对机体
16、而言，免疫耐受与机体免疫系统发育成熟程度有关，而免疫系统的发育又与年龄密切相关。有研究显示，新生儿期感染HBV转为慢性乙型肝炎的比率是95%，这与新生儿免疫系统尚未发育成熟有关。胎内或围产期感染HBV后，体内T细胞将其作为自身抗原加以识别，进而可导致HBV特异性T细胞凋亡和克隆清除（clone deletion），此为胎儿感染HBV慢性化的主要原因。宿主抗原提呈功能减弱是诱导免疫耐受的重要因素。通过氨基酸序列分析发现，HBeAg和HBcAg约有75%共同的氨基酸序列，但是两者的二级结构不同，各有特异的抗原决定簇。HBcAg是一种颗粒性细胞内抗原，不能通过胎盘，但HBeAg作为一种非颗粒性分泌型小分子蛋白，能通过胎盘分泌入血，经血液循环到达胸腺。Song等8在脐带血中测得HBeAg阳性率为56.9%, 而有
