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1、生物转化技术在中药研究中的应用摘要 近年来的研究表明，生物转化技术不仅能改变中药中主要成分的含量、活性物质的结构，扩大药源范围，亦能对有毒中药进行持效减毒。本文以部分中药材种类为例，分别从侧重于改变主要成分含量、改变单一化合物结构、扩大药源和对有毒中药持效减毒等方面介绍生物转化技术在中药研究中的应用。关键词 生物转化; 中药; 单一成分; 药源; 持效减毒生物转化( Biotransformation) ，也称生物催化( Biocatalysis) ，是利用植物离体培养细胞或器官、动物、微生物及细胞器等生物体系对外源底物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是利用生物体系本身所产生
2、的酶对外源化合物进行的酶催化反应。它具有反应选择性强、条件温和、副产物少、环保和后处理简单等一般传统炮制方法所不能比拟的优点，并且可以进行传统化学合成所不能或很难进行的化学反应1。生物转化技术与中药历史渊源已久，隋唐时期就出现了中药发酵初级产品 “神曲”2。生物转化技术应用于毒性中药的炮制古已有之。 本草纲目曰: “半夏研末，以姜汁、白矾汤和作饼，楮叶包置篮中，待生黄衣，晒干用，谓之半 夏曲”3。即用天然的混合菌群处理半夏，伴以其他中药作为辅料，在发酵过程中使它们共同成为药性基质，最终发酵形成具有一定功效的以半夏为主的炮制品( 半夏曲) 。生物转化体系分为微生物生物转化系统及植物生物转化系统。
3、微生物转化是以细菌、霉菌等微生物为体系对外源底物进行结构修饰的化学反应，其实质是利用微生物体内的酶对外源化合物进行催化反应。微生物种类繁多，分布广，繁殖快，易变异，对自然环境的变化有极强的适应能力，含有丰富的酶。利用微生物及其产生的酶进行生物转化能够产生许多有用的化合物4。该方法具有生物量倍增时间短，微生物的基因操作方法已广泛建立等优点。以微生物转化技术为先导建立起来的植物生物转化5，是利用植物、植物组织培养体或从植物体系提取的酶进行的生物转化，能够用来进行生物转化的底物种类众多，几乎包括所有的天然产物，如生物碱类、香豆素类等，一些合成产物也可以进行生物转化6。植物生物转化系统与微生物生物转化
4、系统相比，生物量倍增时间长，产生酶的种类较少且量也较低。但植物生物转化亦有其独特之处: 植物中有许多独特的酶，而微生物中不具有，它们可以催化一定的反应生成许多复杂的化合物，甚至是新化合物7。有研究报道显示，生物转化技术不仅能改变中药中主要成分的含量、活性物质的结构，扩大药源范围，亦能对有毒中药进行持效减毒8-52。但关于转化机制研究则尚未成熟，需要努力挖掘其中的关键酶及代谢过程，才能搞清楚其转化的过程及规律，从而完善生物转化技术的理论及应用。本文以部分中药材种类为例，分别从侧重于改变主要成分含量、改变单一化合物结构、扩大药源和对有毒中药持效减毒等方面介绍生物转化技术在中药研究中的应用。1 生物
5、转化技术对中药主要成分含量的改变1. 1 植物药药材五倍子中主要含有鞣质、没食子酸等物质。鞣质经过肠道时会与蛋白质结合而降低药物作用。为了克服这一缺点，郑利华等8采用含有根霉菌和L-赖氨酸等的酵曲发酵五倍子，形成更多的 L-赖氨酸。由于 L-赖氨酸能促进胃肠道黏膜吸收食物中的蛋白质，有效地避免鞣酸在胃肠道内竞争性消耗，从而提高了五倍子的收敛作用。瞿燕等9通过对五32012 年 2 月 第 14 卷 第 2 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Feb. 2012 Vol. 14 No. 2倍子生品、发酵品中没食子酸的含量测定，发现发酵品中没食子酸的含量高，抗菌和祛痰
6、作用强于生品。大黄中结合型蒽醌是泻下作用的主要有效成分，游离型蒽醌泻下作用极弱。戴万生等10用酒精酵母、面包酵母对大黄进行分别发酵 16 d 后，结合型蒽醌含量明显降低，游离型蒽醌含量大大提高，提示发酵能使大黄中的结合型蒽醌转化为游离型蒽醌，从而缓解大黄的泻下作用。三七的根中有效成分为皂苷。Li 等11采用枯草芽孢杆菌对三七根进行发酵，结果发现，发酵后的三七中含有发酵前三七根中所没有的人参皂苷 Rh4，说明它是通过发酵由其他成分转化而成的。甘草经加工后产生大量残渣。李艳宾等12研究菌种发酵处理对甘草渣中黄酮类化合物提取的影响，结果表明，与乙醇直接提取法相比，经微生物发酵处理能有效提高甘草黄酮的
7、得率，其中经白腐菌、纤维素分解菌发酵后黄酮得率分别为 0. 89%、0. 87% ，比乙醇直接提取法的黄酮得率 ( 0. 66% )提高了 34. 85%、31. 82%; 白腐菌与纤维素分解菌混合发酵处理，黄酮得率达到 1. 32%，与乙醇直接提取法相比提高了 100%。陈易彬等13采用湿热法、氧化法、生物发酵法等方法对银杏叶进行处理，考察不同的处理方法对提取银杏叶黄酮含量的影响，结果生物发酵法所得银杏叶黄酮的含量为 7. 97%，高于其他几种方法。表明，生物发酵法对银杏叶黄酮的作用明显，能够提高银杏叶黄酮的含量。1. 2 动物药斑蝥素是昆虫类中药斑蝥体内的有毒物质，亦是斑蝥抗癌作用的主要有
8、效成分14。临床研究表明，斑蝥素有显著的抗癌作用，对肝癌、食道癌、胃癌、肺癌等均有抑制效果，但斑蝥素的毒副作用较大15。刘高强等16采用微生物转化法对斑蝥素进行结构改造研究，发酵结束后，采用毛细管气相色谱法对药用真菌培养液中斑蝥素的含量进行了测定，结果显示，灵斑菌质等发酵液中斑蝥素的含量较原药材有显著降低。1. 3 矿物药屠娟等17发现发酵工业废水的黑根霉菌对铅、锰、镉、铜有很好的吸附作用，且经化学改性的黑根霉能不同程度地提升吸附能力。这对于含铅等中药，如铅丹、密陀僧、黑锡丹等发酵减毒值得深入研究。2 生物转化技术对单一化合物的结构转化2. 1 生物碱类士的宁是马钱子成熟种子的主要毒性成分。潘
9、扬等18通过真菌发酵技术对马钱子进行生物转化，发现所产生的药性菌质中马钱子类生物碱成分发生了质和量的明显变化，并在生物碱 HPLC 图中可看出多个含量变化较大的或新产生的未知成分。结构鉴定表明，士的宁、马钱子碱都被转化为各自氮氧化物。2. 2 有机酸类刘莹等19利用 25 种真菌对齐墩果酸进行生物转化，经 HPLC 检测，发现其中有 5 种真菌对齐墩果酸有转化，测得的转化率分别为 56. 2%、69. 7%、77. 9% 、81. 6% 、83. 0% 。关木通的茎藤等含有马兜铃酸，这类物质具肝肾毒性和致癌作用。郭永超等20选取短刺小克银汉霉菌对毒性较强的马兜铃酸 A( AA ) 和马兜铃酸B
10、( AA ) 进行转化研究，结果发现，发酵液中主要的转化产物是 AA 的去甲基化物( AA a) ，该产物与报道的哺乳动物在摄入 AA 后尿中发现的一种代谢产物结构相同。天然香兰素一直是香精香料行业关注的重点。董长颖等21通过研究发现，链霉菌 L1936 能将阿魏酸转化为香兰素，研究结果显示，链霉菌 L1936 能够将 6 gL 1阿魏酸转化为 2. 02 gL 1香兰素，相应的摩尔转化率为 42. 97%。此外，赵丹等22研究观察了 150 种真菌对丹参酚酸 B 进行的转化，结果发现一株真菌可高产率转化丹参酚酸 B，转化后得到新的酚酸类活性物质原紫草酸。马晶等23采用刺囊毛霉 AS3. 34
11、50 对甘草次酸进行微生物转化研究，生成的主产物经分析鉴定为 7-羟基甘草次酸。2. 3 内酯类雷公藤去皮的根所含主要有效成分和有毒成分为雷公藤甲素、雷公藤内酯酮等内酯化合物。叶敏等24利用微生物转化技术对雷公藤甲素和雷公藤内酯酮进行生物转化，共得到 17 个产物，其中 11 个为新化合物，体外筛选结果表明大多数转化产物表现出较强的细胞毒活性。据研究报道，短刺小克银汉霉能转化雷公藤甲素，产物种类较多。其中羟基化酶起主要作用，能分别在不同的甲基、亚甲基和次甲基位点上进行单羟基化反应，分别得到5-羟基雷公藤甲素、19-羟基雷公藤甲素、19-羟基雷公藤甲素、1-羟基雷公藤甲素、雷公藤乙素、16-羟基
12、雷公藤甲素、雷醇内42012 年 2 月 第 14 卷 第 2 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Feb. 2012 Vol. 14 No. 2酯，其中前 4 个物质为新化合物25。2. 4 苷类李于善等26以自三峡白首乌提取分离得到的C21甾苷元告达庭甾苷元和开德甾苷元作为底物，采用黑根霉和赭曲霉两种微生物在水-正丁醇双相体系中，以连续转化或同步转化的方法制备 C11-羟基化的白首乌 C21甾苷元告达庭甾苷元和开德甾苷元。包海鹰等27利用菌种黑根霉对人参皂苷 Re 进行生物转化，转化后的人参皂苷发酵产物中含有人参皂苷Rg2及 Rg2的同分异构体和人参皂苷 Rg
13、5/ Rk1。白龙律等28利用 18 种菌株对人参皂苷 Rb1进行生物转化研究，结果发现一种绿毛状 GY-06 菌扩展青霉能够使得人参皂苷 Rb1有效地转化为 Rg3。田天丽等29从中药材虎杖中筛选到一株具有转化虎杖苷能力的根霉菌株 T-34，利用该菌株产生的 -葡萄糖苷酶能将虎杖苷转化为白藜芦醇，并测得虎杖苷的转化率达 98%。王永宏等30筛选到一株产葡萄糖苷酶酶活可达到 8. 2 UmL 1的青霉，并优化了发酵转化条件，使得栀子中主要成分京尼平苷转化成具直接作用的有效成分京尼平，转化率可达到95%以上。2. 5 其他柠檬苦素类化合物是三萜类植物次生代谢产物，主要分布于芸香科和楝科植物中，尤
14、其在柑橘属植物中，此类化合物含量较为丰富。黄柏酮是白鲜皮中含量较高的一个柠檬苦素类化合物，可使昆虫产生拒食行为31，并能使具有抑制微管作用的抗肿瘤药( 如长春新碱) 的活性增强32。为了研究微生物对柠檬苦素类化合物的转化作用，杨若林等33应用黑曲霉等真菌对黄柏酮进行了转化试验，结果表明雅致小克银汉霉在培养温度低于 30时可以催化黄柏酮的结构转化，使其 C-11 位被羟基化。孙敏鸽等34使用荨麻青霉对莪术醇进行生物转化研究。结果分离得到 2 个化合物，分别为 3-羟基莪术醇和 11-R-12-羟基莪术醇。赵明强等35利用人参毛状根可对外源氢醌进行转化得到熊果苷产物。蔡洁等36利用人参毛状根将外源对羟基苯甲醇转化为天麻素，为工业化生产人参属植物所不能合成的熊果苷、天麻素等天然化合物奠定了基础。Hirata等37利用烟草植物悬浮培养细胞对羟基香豆素进行转化，得到相应的 -D-葡萄糖苷产
