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1、1,DNA的损伤和修复,南华大学心血管疾病研究所 动脉硬化学湖南省重点实验室,2,DNA 的损伤和修复,Mutagen (诱变剂）,完全修复,DNA 损伤,碱基的化学反应,损伤的修复,不能有效修复,不完全修复,凋亡,畸变,回复正常,3,诱发DNA损伤的因素： 环境因素：辐射、化学毒物、药物、病毒感染、植物和微生物代谢产物等。 生理因素：机体代谢过程中产生的有毒物质、DNA复制错配、DNA本身的热不稳定性。,第一节 多种因素可引起DNA损伤并具有各自的机制,4,（一）辐射致DNA损伤 根据作用原理的不同： 电离辐射（粒子，粒子，射线，射线等） 直接作用：能量直接传递给大分子而引起结构的破坏 间接
2、作用：辐射先作用于溶剂分子而产生活性物质从 而导致细胞损伤 非电离辐射（紫外线以及能量低于紫外线的电磁辐射）,一、DNA损伤的因素及其机制,5,返回目录,返回主页,6,紫外线的致损伤作用,7,（二）自由基致DNA损伤,自由基：指能够独立存在，核外带有未配对电子的原子和分子。 自由基的产生可以是外界因素与体内物质共同作用的结果。 自由基可导致碱基、核糖、磷酸基的损伤，引起DNA的结构和功能异常。,8,（三）化学毒物致DNA损伤,按其作用原理可分为： 碱基类似物 碱基修饰物 嵌入染料,9,1、碱基类似物（Base analog）,2-氨基嘌呤 2-Amino purine,5-溴尿嘧啶 5-Bro
3、mine Uracil,是指与DNA正常碱基结构类似的化合物,在DNA复制时掺入并与互补链上碱基配对,从而引起碱基对的置换.,10,5-BrU,: G,: A,ATGC 转变,烯醇式渗入为 GCAT 转变,11,2、 碱基的化学修饰剂,又称化学突变剂：指对DNA链中的碱基的修饰,改变其配对性质,进而改变DNA结构的化合物. 亚硝酸（nitrous acid HNO2） 羟氨（hydroxylamine HA） 甲磺酸乙酯（ethyl mathanesulfonate EMS） N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍 （N-mathyl-N-nitro-N-nitrosoguanidion NNG）,
4、12,（a）亚硝酸修饰G、C、A；（b）羟基修饰C；（c）甲基磺酸乙酯修饰T（引自Russell,1992）.,13,3、嵌入染料对DNA的损伤作用,吖啶橙 (Acridine Orange AO),扁平染料分子,溴化乙锭 (Ethidium Bromide EB ),-ATTTTTCG - -TAAAAAGC-,-AT EB TTTTCG- -TA,分子插入,X,AAAAGC-,结果产生移框突变,14,二、DNA损伤的类型,DNA分子中的碱基、核糖和磷酸二酯键等均是DNA损伤作用的靶点。 常见的损伤有:碱基脱落、碱基破坏、嘧啶二聚体形成、单链和双链DNA断裂、DNA交联、DNA-蛋白质交联等
5、。,15,（一） 碱基和核糖的破坏,由于碱基或者核糖的损伤，在DNA链上形成不稳定位点，最终可导致DNA链的断裂。,16,17,DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,1. 转换,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,2. 颠换,（二）错配,18,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,19,（三） DNA链断裂,磷酸二酯键的断裂和脱氧戊糖的破坏是引起DNA链断裂的直接原因。 碱基的破坏和脱落在DNA链上形成的不稳定位点是DNA链断裂的间接原因。 单链断裂（SSB）
6、：一条链断裂的DNA双股螺旋 双链断裂（DSB）：两条链于同一处或紧密相邻处同时断裂。,20,（四）DNA交联,链间交联：DNA双螺旋链上一条链上的碱基和另一条链上的碱基以共价键结合 链内交联：DNA分子中同一条链内的两个碱基以共价键结合 DNA蛋白质交联：DNA和蛋白质以共价键结合,21,第二节 DNA损伤的修复,DNA损伤的修复：指纠正错配的碱基，清除DNA链上的损伤，恢复DNA正常结构的过程。 常见的DNA修复方式：直接修复、切除修复、错配修复和重组修复,22,(一）直接修复,直接修复 细胞对DNA的某些损伤可以用很简单的方式加以修复在单一基因产物的催化下，一步反应就可以完成。这种修复方
7、式叫直接修复。 包括：酶光学复活、嘌呤的直接插入、O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移、单链断裂重接等。,23,1）、酶学光复活（photo reactivation ）,24,烷基化碱基可以直接修复,25,2）嘌呤的直接插入 嘌呤插入酶 受损嘌呤APS 插入嘌呤（糖苷键）,嘌呤插入酶,K+,26,3）DNA单链断裂重接 DNA单链断裂中有一部分是通过简单的重接而修复的，只需要一种酶DNA连接酶(ligase)参加，因此也属于直接修复。 DNA连接酶能催化DNA双螺旋结构中一条链缺口处的5磷酸根与相邻的一个3羟基形成磷酸二酯健。连接所需的能量ATP(如动物细胞)。,27,28,将损伤的部位（或连同其附
8、近的一定部位）切除，然后用正确配对的、完好的碱基替代修复。有多种酶和基因参与 过程：识别（损伤位点）切除修复（补）连接,酶和蛋白质,DNA聚合酶,DNA连接酶,(二)、切除修复,按照产物的不同可以分：碱基切除修复、核苷酸切除修复,29,1)碱基切除： 特点是切除受损伤的碱基。主要过程是水解受损伤的碱基与脱氧核糖磷酸链之间的N糖苷键。反应由一类糖基化酶催化。 也即：糖基化酶APS内、外切酶去除残基以对侧链为模板修补DNA连接酶连接 整个修复过程可分以下几步。,30,DNA糖苷酶识别切除改变的碱基 核酸内切酶切除磷酸二酯键 DNA聚合酶填补 DNA连接酶连接,31,2.识别的酶： （1）一类DNA
9、糖苷酶，各具特异性 e.g.尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U （由C突变而来） （2）作用： 识别-DNA中改变的碱基 水解-受损的碱基与脱氧核糖间的糖苷键 使受损的碱基脱落,32,33,Ecoli的核苷酸切除修复机理。 在Ecoli中，UvrA，UvrB，UvrC三种蛋白必须同时存在才能发挥作用，所以也叫UvrABC切除核酸酶。 UvrA是一种腺苷三磷酸酶，是损伤识别蛋白。它与UvrB 结合成A2B1复合物，结合在损伤区，使DNA解旋、扭曲，并引起UvrB构象改变，与损伤部位形成紧密的结合。 然后UvrA与UvrBDNA复合物解离，后者成为UvrC特异结合靶。 UvrB 在损伤的3侧作一内
10、切，随而复合物构象改变， UvrC 得以在5侧作第二个切口。 解旋酶 (UvrD)使寡聚核苷酸片段及UvrC从DNA链上释放，然后DNA聚合酶取代UvrB。修补缺损区；最后由连接酶连接补片。,2）. 核苷酸切除,34,35,36,当DNA双链发生严重损伤时需要另一种机理来完成正确的修复。 一种情况是两条链同时受到损伤；另一种情况是单链损伤尚未修复时发生了复制，造成对应于损伤位置的新链缺乏正确模板；此时需要重组酶系将另一段未受损伤的双链DNA移到损伤位置附近，提供正确的模板，进行重组。这便是重组修复。,（三） 重组修复,37,重组修复 (链转移修复),复制后修复 容易出错,RecA, DNApo
11、lymerae ligase,二聚体后起始,RecA,聚合酶、连接酶,重组修复后的损伤位点可 由其它机制进一步修复,38,DNApol (= 10-8) 经第二次校正= 10-11,错配修复系统(MRS Mismatch Repair System),错配修复:碱基切除修复的一种特殊形式. 使复制的保真性提高102103倍,（四）、错配修复,39,错配修复系统（Mismatch repair system）,DNA polymerase Helicase SSB 外切核酸酶 (和) 连接酶,MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mutH, L, S,
12、（1）组成,40, DNA合成过程中的甲基化变化,DNA中的GATC(palindromic seq.) 为m6A甲基化敏感位点,平均每2kb左右有一GATC seq.,错配修复系统受甲基化的引导,41,甲基化程度的差异,a、MutH/MutS 扫描识别错配 碱基和邻近的GATC序列 切点甲基化GATC中 G的5侧,DNA helicase II, SSB, exonuclease I去除包括错 配碱基的片段,DNA polymerase III 和 DNA ligase 填充缺口,昂贵的代价用于保证DNA的准确性,（2） 修复过程,42,（五）. 易错修复（SOS修复 SOS repair）
13、,“SOS”是国际上通用的紧急呼救信号。SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复(errorprone repair)，使细胞有较高的突变率。 此系统由十几个修复蛋白组成。调控蛋白LexA参与此 系统的启动。,43,（2） SOS 修复机制,SOS 修复无模板指导的DNA复制,大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生,SOS系统诱导，错误潜伏的复制超越二聚体而进行,44,SOS 修复只是SOS反应的一部分,RecA在SOS反应 反应中起核心作用,RecA与LexA组成调
14、控环路,RecA受LexA的部分抑制,45,RecA-P; 三种功能,46,当DNA复制受阻/ DNA damaged,47,当DNA复制度过难关后,48,二、参与DNA修复的主要基因,DNA修复相关基因： 直接参与DNA修复的基因 DNA修复调控相关的基因,49,第三节 生物标记物可作为DNA损伤和修复的参考标记,1. 甲基化损伤修复相关基因的突变可作为甲基化损伤的基因型标记物。MGMT突变可以作为甲基化损伤的基因型标记物。 2.切除修复相关的酶和基因可作为切除修复的生物标记物。大肠杆菌Uvr基因家族，人ecrr基因。 3.错配修复相关基因可作为检测错配修复功能的标记物。 4.DNA聚合物突变可以为碱基切除修复功能缺陷的标记物。该酶的突变导致碱基切除修复功能的缺陷。,50,5. Ku蛋白和Rad52蛋白缺陷可作为重组修复缺陷的标记物。 6.微生物DNA损伤修复也有相应的生物标记物。如RecA蛋白。 7.特异的代谢酶和代谢产物也可作为生物标记物，如细胞色素P450。 8.DNA加和物也可作为修复功能的生物标记物。,51,返回目录,返回主页,52,返回目录,返回主页,53,返回目录,返回主页,下一页,
