内标的选择

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1、内 标 的 选 择,为什么要用内标法,内标法 指选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中，以待测组分和对照物质的响应信号之比为定量依据，测定待测组分含量的方法。,1. 体内药物分析的特点 （1）药物浓度低 （2）内源性杂质干扰 样品预处理是必经步骤 在预处理过程中,提取时通常不采用反复提取的方法，多半只进行一次（至多两次）提取，一般并不考虑“提取尽药物”。 要达到样品定量测定的目的，提取溶剂必须精确加入，提取液要定量转移，在以后的各个阶段，如蒸发、溶解以及衍生化、进样操作中也要尽可能一致，才能确保各份样品提取率一致 在实际操作中，往往难于达到每次操作的完全平行，因而会引入较大的误

2、差。这种情况下，采用内标法定量就很有必要,内标的基本要求,1. 供选作内标的化合物或药物,其理化性质必须和被测组分十分相近 例如，内标在水相和有机相中的分配情况、挥发性、对萃取容器的吸附性以及层析行为等应与被测组分相似 。分配行为与挥发性近似，才能保证与被测组分有平行的回收率；层析行为相近，其保留时间、峰形才能与被测组分近似，二者峰面积（或峰高）比值才恒定 2. 内标的色谱峰应靠近被测组分的色谱峰，最好位于几个被测组分色谱峰的中间，但又能完全分离 3. 内标浓度的选择 一般内标加入量应控制在使标准曲线中段的药物与内标物响应值（注意不是浓度）比近似为1 4. 对内标的纯度要求 从实际应用角度出发

3、，不苛求内标具有高纯度与高含量，只要求在同一次测定中，标准曲线和样品各管内内标加入量相等 5. 内标物能很好地溶解在样品中，但不能与样品发生化学反应 6. 供作内标的化合物不应当是体内的内源性成分，或药物在体内可能产生的代谢物，并且最好不用患者可能同时使用的其他药物,HPLC为分析方法时内标的选择,一般选择化学结构与被测药物相似的另一种药物或化合物作内标，具体可从以下几个角度考虑 内标与被测药物只相差一个化学元素 例如，测定血浆中的5氟尿嘧啶（5FU）时，可用5氯尿嘧啶（5CU）作内标 内标与被测药物为同系物 例如,测定血中乙醇含量时，可用丙醇作内标 内标物与被测物结构相似（应用最多的方法）

4、例如，体液中抗癫痫药物苯巴比妥的测定，常选用化学结构相似的扑米酮作为内标 少数情况下，也可以选择结构不相似的化合物或药物作为内标，但其理化性质也必须与被测药物相近 例如，曾经泽等在用RPHPLC测定口服苯妥英钠后尿中对羟基苯妥英（P-HDPH）含量时，选择了一般化学试剂对硝基酚作内标,GC为分析方法时内标的选择,应用GC进行体内药物分析时，内标的选择基本与HPLC中相同，但由于GC法本身的一些特点，相应带来一些必须考虑的因素 内标物必须有一定的挥发性，在所选择的GC条件下能够气化 GC测定一般需要在120度以上柱温条件下进行，因此内标必须是遇热稳定的 GC中，衍生化经常是必需的，内标物必须和待

5、测组分发生相同的衍生化反应 GC测定时若采用氮磷检测器（Nitrogen Phosphorus Detector，NPD）或电子捕获检测器（Electron Capture Detector，ECD）时内标仅仅与待测物结构相似还不够，必须相应地含有N（P）或卤素原子，才能被检测器所检测到 例如，用GC测定血清中的氯丙嗪时，采用的是ECD检测器，此时若采用丙嗪作内标，虽然结构很相似，但由于丙嗪分子结构中无电子亲和性很强的氯元素，因此对ECD不敏感，不能产生色谱峰,MS作为检测器时内标的选择,内标在GCMS、LCMS中的作用完全与应用于GC、HPLC中的内标 相同，内标选择的方法既有相似之处，也有

6、本身的一些特点 1. 选择与被测药物结构相近的另一种药物或化合物作为内标 选择的方式以及对内标的要求与色谱法完全相同。例如，用GCMS测定血浆中的利多卡因及其代谢物去乙基利多卡因浓度时，可选择三甲卡因作为内标 2. 选择与被测物具有相同质荷比离子的化合物作为内标 由于在质谱检测时，内标与药物都具有相同质荷比的特征离子，因此检测时就可进行单离子监测，不仅可提高灵敏度，而且可简化操作 内标和待测物虽具有相同的m/z，但因为先经GC柱分离，到达MS就有先后，故可被MS分别检测，不会相互干扰 由于只进行单离子监测，特征离子聚焦在检测器上的时间增多，提高了测定的灵敏度，尤其适于测定药浓低的生物样品,MS

7、作为检测器时内标的选择,选择稳定性同位素标记药物作为内标 MS作为色谱方法的检测器，与一般检测器不同，具有按离子质量差异而将 其在质谱上分开的功能，因此可选择稳定性同位素标记药物作为内标 由于内标（稳定性同位素标记药物）同被测药物化学结构相同，仅个别元素是质量不同的同位素，因此二者的理化性质更为接近，能充分发挥内标在样品预处理过程中的作用 可用于标记的稳定性同位素有2H、13C、15N、18O和37Cl等，其中后四种同位素标记的药物虽然其理化性质更接近原药，但价格贵，标记时采用的化学反应也复杂，实际应用较少。相对而言，2H（Deaterium，常简写为D或d）是标记时常用的稳定性同位素 应用时

8、亦需注意: 虽然MS可按质量差异将质谱离子分开，但也要求标记的稳定性同位素有足够数量，即标记药物比原药至少应多3个质量单位才易分开。当2H标记时也不能标记得太多，一般以标记35个2H为宜，若标记太多，则标记物的理化性质可能会显著偏离原药（同位素效应），削弱了内标应有的作用,MS作为检测器时内标的选择,使用稳定性同位素标记药物作为内标有许多优点 (1) 因为内标与被测组分是同一化合物，仅是分子量大了13个质量单位，其他的化学性质和物理性质都是相同的，所以在一般情况下不可能被色谱分离（即保留时间相同），也没有必要分离开，因为用MS检测时，内标和被测药物选择监测离子存在质量差异，能被MS分离并分别检

9、测。可以简化色谱条件 (2) 可以进一步确证样品 当使用同位素标准品后，由于待测组分与氚代或13C代标准品是同一种物质，所以二者同种离子的丰度比应该相同这样可进一步确证化合物 例如，确定可卡因的代谢产物苯甲酰爱冈宁时，除用计算机解析得到苯甲酰爱冈宁的几个可能结构外，还可用待测组分的m/z 210（丰度为100）、272（34）、331（62）和氚代标准品m/z 213（100）、275（34）、334（62）来确证，这样误判率就会极小 (3) 稳定性同位素原子核不会自发放出射线，无辐射性伤害和放射性污染,内 标 的 评 价,用内标法定量时选择合适的内标有极其重要的意义，但选择的内标是否合适应有

10、客观的判断标准。下面介绍几种评价内标的方法 用若干含药物与内标量比例相同的的溶液直接进样，以峰高比是否恒定来评价 此法采用药物和内标的纯品作试验，未考察其在生物基质中经预处理后的情况，实验结果仅具有一些参考价值，但对于确定加入内标的合适量有一定意义 采用测定药物与内标自空白血浆中回收率的相关性，以此来评价内标是否合适 例如，1978年Mcallister用GC测定血浆中安定浓度时，选择了与安定结构相近的普拉西泮和去甲羟安定作内标，实验中考察了经相应处理后安定和内标自血浆中的回收率，作出安定与普拉西泮（内标1）和安定与去甲羟安定（内标2）回收率的相关性 用普拉西泮作内标时，因其结构与安定相近，二

11、者的回收率相关性很好（r=0.84）,血浆样品测定结果有较高的准确度，误差在7以内。相反，若用去甲羟安定作为内标，因其化学结构中增加了一个极性大的羟基，故理化性质与安定有较大的差异，在同样条件下它的回收率与安定相差较大，相关性很差（r0.19），导致血浆中安定测定的误差达50,内 标 的 评 价,内 标 的 评 价,用误差传递规律判断内标是否改善分析方法的精密度 1981年Haefelfinger提出了这种比较系统的、有数值指标可供判断的内标评价简便方法。经过一系列的推导，可得出两个判断内标是否改善分析方法精密度的数学式: RSDQ2rRSDa,也表明不能改进分析方法的精密度,多 内 标 法,

12、下列两种情况下可考虑采用多内标法 样品中需同时测定的组分较多，并且它们各自之间保留时间差别较大 有的样品含多种药物，或含一种药物但含多种代谢物，这些被测组分之间理化性质差异较大，导致出峰时间及峰形差异也较大，若仅使用一种内标，则常常其保留时间及峰形不能满足所有组分。 这种情况下，可考虑使用两个内标，其保留时间一前一后，分别用于出峰早的和出峰晚的被测组分峰的定量，以提高分析方法的精确度和准确度 样品中被测组分的浓度相差较大 样品中有时含两个被测组分（如药物与代谢物）浓度差别较大，则难于确定内标加入量。若加入量较多，虽能满足高浓度组分，使其与内标响应值之比在合适范围内，但会导致低浓度组分与内标的峰

13、响应值之比太低；反之，若减少内标加入量以满足低浓度组分，又会导致高浓度组分与内标的响应值之比偏高 这种情况下，可以往样品中同时加入多个内标，如加入两个内标（称双内标法），其中一个内标的加入量较多，可以作为样品中浓度高的药物之定量用，另一内标则加入量较少,专门用于低浓度药物定量,实际工作中的几点体会,首先看看自己实验室现有的标准品中有哪些与被测物的结构相似,在所选择的波长处有吸收；另外可查查拟选择的内标的文献报道的分析方法，比较与初步确定的待测样品的色谱条件是否相似 当遇到某药物为合适的内标，却无原料药物可供使用的情况时，可从该药物的制剂中提取，并适当精制处理。只要无干扰分析的杂质存在，组成稳定

14、，即可供作内标使用 当采用梯度洗脱程序时，待测物和内标应在梯度程序的同一段中出峰 在LCMS、GCMS作为分析方法时，由于雾化效率、离子化效率等等总是处于波动之中，重现性不及HPLC，所以内标的选择更为必要和关键，必须注意内标质谱行为的稳定性,实际工作中的几点体会,影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类 由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现，包括： （1）、内标物在样品里混合不好 （2）、内标物和样品组分之间发生反应 （3）、内标物纯度可变等 对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题

15、(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和 如果认为方法比较可靠，而色谱方面看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定 6. 在LC-MS的测定过程中，有可能发现在标曲中随着药物浓度的增高，其与内标的面积比漂移，标曲的线性甚至都不及不加内标时。这有可能是由于基质效应

16、的存在,两个与内标有联系又必须相互区别的概念,1.生物内标 本文所讨论的内标仅仅指通常讲的“分析内标”。而生物内标是指将标记药物与未标记药物一同用于人体，以消除由于不同时间给药引起的个体内误差，测试药物在临床特定情况下的药代动力学特征。这是的标记药物成为“生物内标”。 2. 分析载体 分析载体(analytical carrier)是在样品测定前外加的一种药物或化合物,主要用于增加药物在预处理过程中的绝对回收率,由此间接提高分析方法的精密度。 分析载体与内标的作用显然不同,但从二者的选择与应用来看,有许多相似之处及共同点。具体可参阅相关文献 。,小 结,内标的选择是一项看似简单实则不易的 工作。只有在掌握扎实的理论基础上，通过不断 的在实践中摸索、总结，才能避免盲目试验，快 速而有效地选择出合适的内标,The end,谢谢大家,