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1、生物化学实验厦门大学环境与生态学院2016.2目 录实验室守则1实验记录及实验报告2实验一 淀粉的提取和水解4实验二 总糖与还原糖的测定6实验三 粗纤维的测定9实验四 酪蛋白的制备12实验五 粗脂肪的定量测定索氏提取法14实验六 蛋白质等电点测定16实验七 氨基酸的分离鉴定纸层析法18实验八 蛋白质含量的测定21实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳34实验十 影响酶活性的因素41实验十一 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定45实验十二 凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶51实验十三 DEAE-纤维素柱层析纯化碱性磷酸酶56实验十四 底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定）58实验十五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板
2、电泳分离血清蛋白61实验十六 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点69实验十七 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量74实验十八 维生素C的定量测定79实验十九 猪脾DNA的制备84实验二十 DNA的定量测定87实验二十一 DNA的琼脂糖凝胶电泳89实验二十二 RNA的定量测定92实验二十三 肌糖原的酵解作用94实验二十四 茶叶多糖的提纯与鉴定97仪器的使用99附录101实 验 室 守 则1、遵守课堂纪律，认真进行实验 每个学员应该自觉地遵守课堂纪律，维护课堂秩序，保持室内安静，不大声谈笑。实验过程中要听从教师指导，严格认真地按操作规程进行实验。并简要、准确地将实验结果和数据记
3、录在实验记录本上，完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室、实验后要认真写好实验报告，由课代表按期收交给教师，不无故拖延。2、保持整洁保持环境和仪器的整齐清洁是做好实验的重要条件，也是每个实验者必须养成的良好的工作习惯。实验台面和试剂药品架上都必须保持整洁，仪器药品放置要有次序，不要把试剂、药品洒在实验台面和地上，废液应倒进水槽内（强酸强碱必须都应倒入废品缸内，不可倒入水槽或随地乱扔。实验完毕需将仪器洗净收好，药品试剂排列整齐。注意保持实验台面干净及实验室整齐清洁。3、药品使用 使用药品试剂必须注意节约杜绝浪费，要特别注意保持药品和试剂的纯净，药品用后须立即将瓶盖塞紧放回原处，从瓶中取出的试剂
4、，标准溶液等，如未用尽切勿倒回瓶内，避免混杂。4、仪器使用 各种仪器用具均应注意爱护，细心使用，防止损坏，使用电子天平，分光光度计和离心机等贵重精密仪器，要严格遵守操作规程，发现故障立即报告教师，不要自己动手检修，要爱护国家财产，厉行节约。5、注意安全 为了有效地维护实验室安全，保证实验正常进行，要求： 1）要严格做到：火着人在，人走火灭； 2）勿使乙醚、丙酮、醇类等易燃液体接近火焰，蒸发或加热此类液体时，必须在水浴上进行，切勿用直火加热； 3）凡比水轻且不与水相混溶之物（如醚、苯、汽油等）着火时，应迅速用湿毛巾覆盖火焰，以隔绝空气使其熄灭，绝不能倒水于其上，以免火焰蔓延，对于易与水混溶之物（
5、如乙醇、丙酮等）着火时，可用火扑灭之； 4）有不少药品是有毒或有腐蚀性的不可用手直接拿药品，不可将试剂瓶直接对准鼻子闻，更不可尝药品味道。用移液管吸取有毒试剂，强酸和强碱时，均应用洗耳球，严禁用口吸取； 5）离开实验室时，要关好水龙头，拉下电闸，认真负责地进行检查，严防不安全事故； 6）每次实验课由班长安排同学轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性工作。 实验记录及实验报告一、实验记录 实验课前应认真预习，将实验名称、目的和要求、原理、实验内容、操作方法和步骤等简单扼要地写在预习报告中。 实验中观察到的现象、结果和数据，应该及时地直接记在预习报告中，绝对不可以用单片纸做记录或
6、草稿。实验记录不要抹擦及涂改，写错时可以准确地划去重写，记录时必须使用钢笔或圆珠笔。原始记录必须准确、简炼、详尽、清楚，从实验课开始就应养成这种良好的习惯。 记录时，应做到正确记录实验结果，切忌夹杂主观因素，这是十分重要的。在实验条件下观察到的现象，应如实仔细地记录下来；在定量实验中观测的数据，如称量物的重量，滴定管的读数，分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如，光密度值为0.050，不应写成0.05。实验记录上的每一个数字，都是反映每一次的测量结果，所以，重复观测时即使数据完全相同也应如实记录下来。总之，实验的每个结果都应正确无遗漏
7、地做好记录。 实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量准确的浓度等，都应记录清楚，以便总结实验进行校对和作为查找成败原因的参考依据。 如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，在获得老师允许后，应当重做实验。因为，将不可靠的结果当做正确的记录，在实际工作中可能造成难以估计的损失，所以，在学习期间就应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。 二、实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告按照实验内容可分为定性和定量实验两大类，下面分别列举这两类实验报告的格式，仅供参考。 l、关于定性实验报告 实验（编号）（实验名称） （一）目的和要求 （二）原理 （三）试剂和仪器 （四
8、）操作方法 （五）结果与讨论 一般每次实验课做数个定性实验，实验报告中的实验名称和目的要求应该是针对这次实验课的全部内容而必须达到的目的和要求。在写实验报告时，可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法（或步骤）可以采用工艺流程图的方式或自行设计的表格来表示（某些实验的操作方法可以和结果与讨论部分合并，自行设计各种表格综合书写）。结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题（和思考题）进行探讨以及对实验的改进意见等。 2、关于定量实验报告 实验（编号）（实验名称） （一）目的和要求 （二）原理 （三）试剂和仪器 （四）操作方法 （五）结果
9、处理 （六）讨论 通常每次实验课只做一个定量实验，在实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂及仪器）和操作的关键环节必须写清楚，对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图（以及比较实验组与对照组实验结果的图表）等。（另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析）。讨论部分可以包括：关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象（以及思考题）进行探讨，对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。实验一
10、淀粉的提取和水解一、目的要求掌握淀粉提取和水解的原理及操作方法。二、 原理 多糖是自然界分布最广的糖类，由多个单糖分子缩合而成，具有多种生物学功能，如植物纤维素可构成植物的骨架，而淀粉、糖原则作为营养的存储形式。本实验以地瓜为原料，利用多糖能和水形成胶体溶液的原理，采用过滤、离心等方法提取淀粉。 糖苷键对酸和酶敏感，所以淀粉在酸和体内淀粉酶的作用下被降解成单糖，这种降解过程是逐步进行的，降解的中间产物遇碘曾现不同的颜色： （无色） （红色） （紫蓝色） 淀粉 红色糊精 无色糊精 麦芽糖 葡萄糖 所以根据水解液和碘反应的颜色，可以判断水解是否已完全。本实验中采用酸水解的方法，用过量的酸保证水解完
11、全。三、试剂与器材试剂： 6 mol/L盐酸、6 mol/L氢氧化钠 器材：高速组织捣碎机、恒温水浴锅、电磁炉四、操作方法（1）淀粉的提取甘薯去皮切成小块（约0.30.30.3cm3），准确称取15g，加入60mL 蒸馏水，放入组织捣碎机中捣碎1min（以上步骤可以4组合作）。匀浆液用三层纱布过滤，滤渣用少量水洗，滤液合并后置50oC 恒温水浴中保温30min。轻轻地尽量倾去上层有色溶液，用25 mL蒸馏水重新悬浮白色沉淀，待重新沉淀后再倾去上层溶液，滤纸过滤或用离心机离心（3000 r/m，10 min），再用少量水洗沉淀，3000 r/m离心10 min，连滤纸移至培养皿中置烘箱内烘干（1
12、05烘干4h）后称重。（2）淀粉的水解 称取淀粉1.0 g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入15 mL水和6 mol/L盐酸10 mL，搅拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用6 mol/L氢氧化钠中和至溶液呈中性，然后定容至100 mL，再取10 mL定容到100 mL成为稀释1000倍的总糖水解液。五、注意事项（1） 淀粉提取时水浴温度不能超过50，否则会因淀粉溶解度增大而减少产量； （2） 倾出上清时要尽可能小心，避免沉降的淀粉被震动起来。（3） 离心机使用时要注意先进行离心管的平衡。六、思考题 （1）如何选择生化物质实验中的实验材料？有何标准？（2）材料的破碎方法有哪些？实验二
13、总糖与还原糖的测定一、目的要求 掌握碱性铜试剂法测定还原糖的原理和操作方法。二、原理 单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。还原糖的测定方法多种，本实验采用间接滴定法。其原理是：在碱性溶液中，二价铜离子被还原糖还原成一价的氧化亚铜，氧化亚铜在酸性环境中与一定量的过量碘起反应， 再用标准硫代硫酸钠滴定剩余的碘，即可算出还原糖的含量。反应方程式是：三、试剂与器材 1. 试剂（1） 铜试剂：（A）13 g 硫酸铜加水至1000 mL(B) 24 g酒石酸钾钠（用以保持铜离子碱性
14、液中不生成Cu(OH)2沉淀）；用以保持一定的碱性环境环境 40 g无水碳酸钠50 g碳酸氢钠36 g草酸钾（用以抑制铜离子的还原）1.6 g碘酸钾（用以从碘化钾溶液中释放出一定量的自由碘）制备溶液B时，先用500 mL热水溶化、，再加、，然后加水至1000 mL，最后将（A）、（B）等量混合。（2） 0.005 mol/L硫代硫酸钠：1.24 g硫代硫酸钠和0.1 g碳酸钠加水配成1000 mL。 （3） 1%淀粉：1 g可溶性淀粉溶于100 mL饱和的NaCl溶液中煮沸。（4） 2%碘化钾：20 g KI 用水溶至1000 mL。（5） 2 mol/L硫酸：166.6 mL母液溶于水至1500 mL。（6） 0.5 mg/mL标准葡萄糖：0.5 g葡萄糖加水至1000 mL。 2. 器材 碱式滴定管、电磁炉四、操作步骤（1）样品中总糖的水解： 称取淀粉1.0 g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入15 mL水和6 mol/L盐酸10 mL，搅拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用6 mol
