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1、第二章培养基灭菌MediumSterilization,生化工程学的起点,1.抗杂菌污染的纯种培养技术(pureculture)：无菌空气、培养基灭菌(sterilization)、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。2.通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。,建立关键技术：,奠定生化工程学科基础。,生物反应过程示意图,目的：发酵过程要求纯培养灭菌(sterilization):培养基(medium)空气发酵罐及管道消毒(disinfection)生产环境灭菌与消毒的区别？,第一节概述,一灭菌方法,二培养基及设备的灭菌（进罐后或进罐前灭菌）1.分批灭菌(batchsteriliza
2、tion)实罐灭菌(实消)：利用热空气或高压蒸汽对培养基与发酵罐同时灭菌。,分批灭菌方法:预热加热冷却,分批灭菌的特点：适用于：培养基易发泡或黏度大优点：操作简便，无需连消的设备，并减少了杂菌污染的机会缺点：升温降温时间长，设备利用率低,2连续灭菌(continuoussterilization)(连消)：培养基通过连续灭菌装置，快速连续加热灭菌，后进入灭菌的空罐。培养基时间与温度的变化关系,连续培养下时间与温度的变化关系,连续灭菌装置：1).连消塔保温罐连续灭菌2).板式热交换器连续灭菌3).蒸汽喷射连续灭菌,连消塔保温罐连续灭菌,板式热交换器连续灭菌,适用于各类饮料及工业液体加热、杀菌、冷
3、却、蒸发、冷凝和热回收等多种工艺过程,蒸汽喷射连续灭菌,分批灭菌与连续灭菌的特点,3.空罐灭菌：空罐体灭菌罐压：1.52.0105Pa；罐温：125130，时间：3045min4.发酵附属设备及管道灭菌：管道：罐压3.5105Pa；时间：11.5h补料罐：糖水罐罐压1.5105Pa；时间：30min消泡剂罐罐压：1.51.8105Pa；时间：60min空气过滤器：罐压3.5105Pa；蒸汽从上至下通入,第二节加热灭菌的原理培养基灭菌要求：达到需要的无菌程度；有效成分受热破坏程度尽可能低。灭菌工作关键：控制加热温度（T）和受热时间(t),一、加热灭菌原理1、微生物的热阻：微生物对热的抵抗力称为热
4、阻。（1）微生物对热的抵抗能力营养细胞：在60加热10min全部死亡；细菌芽孢：能耐较高的温度，在100需几分钟或几小时。嗜热菌的芽孢：120，39min或更长时间.（2）致死温度：杀死微生物的极限温度。（3）致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。,2、微生物的热死规律-对数残留定律热死亡动力学(一级反应动力学)规律：菌的死亡速率dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比。即：dN/dtKN(1)dN/dt：死亡速率，菌体瞬时变化率。N：残存活菌数，t：灭菌时间（min，s），K：比死亡速率常数或反应速率常数min1，s1,将(1)式移项积分：ln(Ns/N0)=Kt(2)可变形为
5、：lnNs=Kt+lnN0或Ns=N0eKt或t=1/K*ln(N0/Ns)N0：原有活菌数（t=0,污染度）Ns：经t时间后残存活菌数（灭菌度，Ns103）,二K比死亡速率常数（反应速率常数）1K大小反映微生物受热死亡的难易程度。与微生物的种类及加热温度有关；相同温度下，k值愈小，加热时间长，则此微生物愈耐热。即：t=1/K*ln(N0/Ns),同一种微生物在不同灭菌温度下，灭菌温度愈低，k值愈；温度愈高，k值愈。t=1/K*ln(N0/Ns),K是温度T的函数，故T对K的影响是热灭菌设计的核心问题之一。,2温度T对K的影响T与K的关系，可用Arrhenius方程表示：K=AeE/RTK：比
6、死亡速率常数，也称反应速率常数（min1或s1）A：阿氏常数(s1）E：活化能（J/mol）化学反应中，反应物分子到达活化分子所需的最小能量。活化能的大小与反应速率相关，活化能越低，反应速率越快，因此降低活化能会有效地促进反应的进行。T：绝对温度（K），T（K）t()+273R：气体常数(8.31J/molK)e:2.718因：t=1/K*ln(N0/Ns)故：t=eE/RT*1/A*ln(N0/Ns),3与K有关的表示方法：D（1/10衰减时间）decimalreactiontime：活微生物在受热过程中减少到原来数目的1/10所需要的时间。与K的关系为：D=ln(0.1N0/N0)/K=2
7、.303lg0.1/K=2.303/K,灭菌标准：以杀死耐热芽孢杆菌为准：Es=68700cal/mol.k,As=7.941038(s-1)即:K=7.941038e-68700/1.98T,三营养受热分解规律符合微生物热死亡动力学规律和Arrhenius方程：dC/dt=KC可变形为：ln(Cs/Co)=Kt或Cs=C0eKtK=AeE/RTK：营养成分受热分解速率常数（min1,s1）E：营养成分受热分解反应的活化能（J/mol）,化学反应动力学：活化能大的反应，反应速度随温度的变化也大；反之，反应速度随温度的变化也小。注：微生物受热死亡的活化能E比营养成分受热分解的活化能E大。E大，说
8、明反应速率随温度变化也大；当温度升高，微生物死亡速度比营养成分分解速度快。,当温度升高，微生物死亡速度比营养成分分解速度快。故采取高温瞬时，有利于快速杀灭菌体，而且减少营养的破坏。,例题：1.若温度从120升至150，分别计算120和150下的VB1的分解速率常数KB和嗜热芽孢杆菌的比死亡速率常数Ks；并比较KB150/KB120;Ks150/Ks120，反映何种规律。已知EB1=92114J/mol,AB1=9.301010（min-1）;Es=284460J/mol,As=1.341036(min-1)2.在120下灭菌7.6min，计算此时VC的损失率。(120下，若Kc0.055min
9、1),问题：为何工业上采用高温瞬时的灭菌方式？,第三节分批灭菌培养基和发酵罐同时灭菌，冷却至发酵温度再接种发酵。又称间歇灭菌或实罐灭菌（实消）。分批灭菌的特点：适用于：培养基易发泡或黏度大优点：操作简便，无需连消的设备，并减少了杂菌污染的机会缺点：升温降温时间长，设备利用率低,一灭菌效果(灭菌准数、灭菌值）当灭菌温度恒定下，培养基中微生物死亡遵循：lnN0/Ns=kt当温度随时间变化时，K也变化：积分得ln(No/Ns)=A升温、维持和冷却过程的灭菌效果为：V总=ln(No/Ns)V加+V保V冷V加ln(No/N1)AV保ln(N1/N2)K（t2-t1）V冷ln(N2/Ns)A,二分批灭菌讨论工业灭菌，灭菌周期约35h,各阶段的灭菌贡献大致为：V加/V总=0.2,V保/V总=0.75,V冷/V总=0.05,3.某厂培养基初始杂菌数为106个/ml,生产要求最终无菌度为10-3。当发酵容器由1m3放大至10m3时，总灭菌效果增加多少。,4.发酵培养基60m3，初始杂菌数为105个/ml,生产要求最终无菌度为10-3。采用分批灭菌方式，120维持5min.已知升温和降温的灭菌效果不超过总灭菌度效果的25。则所设计的T-t过程是否达到无菌要求。如何改进。,
