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1、福尔马林固定石蜡包埋组织DNA的提取及影响因素,2012.12娄全博,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类的疾病研究，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展等方面均具有重要意义。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。,Goelz(1985)
2、成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。,石蜡包埋组织DNA提取的流程图,组织包埋制作过程中的影响因素,1.1福尔马林固定福尔马林固定液的主要成分：甲醛是最小的含氧有机物，具有较高的反应活性，可以和带有-OH（羟基）、-SH（巯基）、-NH2（氨基）的分子发生亲核加成反应，最终作为亚甲基(-CH2-)的提供者，与上述基团中的两个基团反应，使自由的分子链被交联起来，从而发挥对组织固定的作用
3、，同时也对DNA分子产生不利的影响。最早表现为DNA分子呈可逆性亚氨基和氨基的羟甲基化，随固定时间延长，生物大分子之间缓慢形成广泛的亚甲基交联桥，导致DNA链的脆性增加，在受到剪切力作用时，更容易发生随机断裂1。,甲醛介导的DNA损伤，在固定3h后已发生。固定时间越长，甲醛所致DNA损伤越严重，越不易从中获得大片段DNA。相关文献记载固定时间分别为3、7、16、32d且保存15年的包埋组织进行研究的结果显示，固定16d可成功获取250bp左右的DNA片段，固定32d则仅能获取100bp左右DNA片段2。甲醛除本身可造成DNA分子损伤外，其与氧化性物质接触后形成的甲酸，可改变环境pH，从而影响D
4、NA分子稳定性，使核酸中嘌呤基的糖苷键容易发生水解而导致DNA链断裂3。实验证明，中性缓冲型福尔马林固定剂能有效中和甲醛氧化生成的甲酸，使环境pH得以稳定，在所提取DNA的质和量上都明显优于其他固定剂。,1.2浸蜡与包埋用于组织包埋的固体石蜡为多种烃烷混合物，溶程为5065，其化学性质稳定，在通常条件下不与酸性（除硝酸外）和碱性溶液发生作用。迄今尚无石蜡能直接导致包埋组织中DNA降解的报道。但有文献记载，在石蜡包埋过程中DNA更容易发生降解。其可能的机制是组织浸蜡与包埋时需要加热到62左右，此时DNA部分解链，组织内残留的痕量甲醛可对解链后的DNA单链进行甲基化修饰，修饰后的DNA单链在冷却后
5、不易复性而导致的降解4。另外，石蜡可阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K与组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA释放。在DNA提取过程中，如未能有效去除石蜡，形成的DNA-石蜡混合液，不利于PCR扩增5。,1.3切片规格为保证包埋组织中提取的DNA量能够满足后续检验的需求，可通过增加切片厚度或增加切片的张数来实现。但切片过厚不利于组织脱蜡和蛋白酶消化，而切片过薄易造成DNA的机械损伤，同时切片总面积的增加，其表面黏附的PCR抑制因子将可能增多6。文献中对比观察切片厚度为2.5m、5.0m和10.0m三种情况下进行二甲苯脱蜡后，有机溶剂法提取DNA的质量差异。三者比较，10.0m切片DNA质
6、量最好，2.5m切片提取的DNA在PCR扩增后电泳，虽可见目的基因条带，但条带较淡，目的基因测序图混乱，难以读出碱基序列，效果远不如其他两种情况7。,DNA提取的预处理脱蜡,为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性PCR抑制因子的和尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底地脱蜡，这是与其他生物性检材提取DNA过程的最大不同点。,2.1有机溶剂脱蜡法二甲苯是被常用于包埋组织脱蜡的高效有机溶剂。首先将石蜡包埋的组织浸泡在二甲苯溶液中于室温下脱蜡，一般进行两次，分别为2h和12h。然后用梯度乙醇(100%至70%)复水，使组织结构疏松,利于消化液渗入，同时去除组织中痕
7、量的二甲苯和甲醛。待乙醇自然挥发后将组织浸泡于消化缓冲液。根据需要，可适当提高二甲苯脱蜡的温度(48或65)、增加脱蜡的次数、延长脱蜡或复水时间等。该法脱蜡比较彻底，利于组织消化，但是过多的操作步骤增加了DNA受污染的可能，亦容易人为地造成DNA机械性损伤，并且需要接触有毒物质二甲苯。,2.2加热脱蜡法通过加热使石蜡溶解，继而从组织中分离出来的方法，比较省时省力，同时也避免了接触有毒化学试剂。但DNA受热后不稳定，组织内释放出的一些金属离子以及核酸酶等易对其造成损伤，加热温度越高时间越长，DNA受损则越严重。另外,组织受热不均,脱蜡有不彻底的可能。,2.2.1水浴加热脱蜡法将组织样本浸泡于生理
8、盐水中，在接近石蜡熔点的温度（65）下水浴，重复1次2次，可达到去除石蜡的目的。有研究表明，水浴加热时间与大片段DNA检出率成反比,建议采用65水浴10min效果较好8。也有研究提出用TES液（10mmolTris-HCl、1mmolEDTA、0.5%SDS）代替生理盐水进行水浴加热脱蜡,能有效提高DNA的产量和质量9。,2.2.2微波加热脱蜡法将装有组织切片的离心管中加入消化缓冲液(50mmol/LTris，1mmol/LEDTA，0.5%Tween20pH8.5)，密封后，置于微波炉中加热2min（时间长短视石蜡而定），利用电磁波的穿透力，对组织进行深层加热，可在短时间内对组织进行比较彻底
9、地脱蜡10。该法与传统的二甲苯脱蜡法相比，具有高产量提取，高效率扩增的优势，而且具有操作简单、实验消耗少、污染危险性小等优点，是一种值得提倡的方法。,包埋组织中DNA提取的注意事项,3.1蛋白酶K的消化作用3.1.1酶浓度适当地增加蛋白酶K浓度和延长消化时间将有利于组织消化和DNA的释放。通过比较不同浓度蛋白酶K（0.5mg/mL，1.0mg/mL和4.0mg/mL）对包埋组织的消化效果后发现，消化液中蛋白酶K浓度越高，消化时间越长获取的DNA量越多。然而，随着蛋白酶K浓度的升高，提取的DNA数量虽然增多，但质量反而有所下降，对较大DNA片段（大于200bp）进行PCR扩增的成功率也下降，其原
10、因不明11。,3.1.2消化温度蛋白酶K的最佳工作温度是56,温度过低不利于发挥蛋白酶K活性，过高则不利于保护DNA的完整性，故新鲜组织与冰冻组织通常选择37下消化过夜。研究表明37和56两个温度下蛋白酶K消化包埋组织的效果进行了比较，发现56消化不仅可获得较多量的DNA，而且可产生高质量的DNA12。,3.1.3消化缓冲液的离子强度在高离子强度的环境下，生物大分子链趋于高度螺旋收缩状态，因此，甲醛介导的DNA与核蛋白之间的交联结构，在中、高离子强度下将得以稳定存在。反之，采用低离子强度的消化缓冲液将利于舒展其分子结构，从而促进蛋白酶的消化作用。,3.2选择合适的DNA提取方法DNA分子因受甲
11、醛作用脆性增加，受机械剪切力作用后容易发生断裂。因此，提取DNA过程中，应当避免剧烈振荡和过高的温度，尽量减少提取过程中的操作步骤，以减少对DNA分子的额外损伤。包埋组织中DNA提取方法主要分为两类。一类是基于蛋白酶K消化的DNA提取方法,其中有机溶剂法提取的DNA在纯度上有着明显的优越性，但其实验过程中需多次移管、震摇和离心操作，既容易加重DNA的机械损伤，又容易导致外来PCR抑制物的污染。,氯化钠盐析法是通过在包埋组织经蛋白酶K消化后的溶液中加入高浓度盐溶液（等体积3mol/L的NaCl溶液），破坏蛋白质在水中的稳定性因素而达到沉淀的目的，其实验过程简便快捷、造价低廉、无须接触有毒化学试剂
12、，而DNA产量和PCR分型成功率与前者效果相当。另一类是基于水煮加热的一步提取法，在水煮液中加入终浓度10%的Chelex-100或终浓度1%的Tritonx-100。Chelex-100是一种由聚乙烯乙二烯苯组成的螯合基团，能螯合包埋组织在高温裂解后释放的内源性二价金属离子，如Mg2+、Ca2+等,从而阻止其在高温下与断裂DNA的作用;Tritonx-100则是一种强的非离子表面活性剂，能促进蛋白成份变性溶解。,3.3去除PCR抑制因子包埋组织提取DNA中存在着一些不能通过蛋白酶K消化和有机萃取法去除的PCR反应抑制因子，随包埋组织取量的增加,其抑制效果越明显13。例如，包埋组织中DNA严重
13、降解后出现的大量寡核苷酸碎片，在PCR扩增时，可竞争性结合反应体系中的Mg2+，降低Mg2+的有效浓度，从而降低DNA聚合酶酶的活性，同时还可干扰引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。采用凝胶层析技术可以有效地去除寡核苷酸片段的影响,总而言之，包埋组织中DNA的提取和PCR的扩增比较困难，影响因素颇多，研究还不是十分透彻。上述各种方法虽各具针对性，但是基于效率、卫生、经济，尤其实验稳定性的考虑，都不很理想。对于包埋组织中客观存在的PCR扩增抑制因子的研究并不明朗，300bp以上DNA片段的提取和PCR扩增的成功率非常低,500bp以上片段的成功率则是偶有报道12，这很难满足医学科研需要。因此，
14、建立一种实用、有效的从包埋组织中提取DNA的方法，合理调整制定PCR扩增对策等问题,还将有待进一步深入的研究。,参考文献,1MiesC,HouldsworthJ,ChagantiRS.ExtractionofDNAfromparaffinblocksforSouthernblotanalysisJ.AmJSurgPathol,1991,15(2):169-174.2LegrandB,MazancourtP,DurigonM,etal.DNAgenotypingofunbufferedformalinfixedparaffinem-beddedtissuesJ.ForensicSciInt,20
15、02,125:205-211.3VZsikla,BaumannM,CathomasG.EffectofbufferedformalinonamplificationofDNAfromparaffinwaxembeddedsmallbiopsiesusingreal-timePCRJ.ClinPathol,2004,57:654-656.4MoerkerkPT,KesselsHJ,TenKateJ,etal.SouthernanddotblotanalysisofDNAfromformalin-embeddedtissuesamplesfromcoloniccarcinomasJ.Virchow
16、sArchBCellPatholInclMolPathol,1990,58(5):351-355.5LonnU,LonnS,NilssonB,etal.Demonstrationofgeneamplifica-tionbyPCRinarchivalparaffinembeddedbreastcancertissueJ.BreastCancerResTreat,1994,30(2):147-152.,6LegrandB,MazancourtP,DurigonM,etal.DNAgenotypingofunbufferedformalinfixedparaffinem-beddedtissuesJ.ForensicSciInt,2002,125:205-211.7盖宝东,房学东,金仲田.提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究J.吉林大学学报(医学版),2003,29(1):115-118.8周毅,严红,李万水,等.石蜡包埋人体组织DNA分型的研究J.刑事技术,2003,4:17-18.9刘德莉.一种石蜡包埋组织DNA提取方法J.上海医学检验杂志,2000,15(2):128.10Sat
