现代分子生物学第五章资料讲解

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1、第 五 章 分子生物学基本研究法 （上）DNA、RNA及蛋白质操作技术,重组DNA操作过程示意图,Gregor Mendel (1822-1884). The Father of Genetics,现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。该技术是核

2、酸操作的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种寄主细胞中的繁衍与表达。,事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。 DNA操作技术 基因克隆的常用载体系统 基因的分离与鉴定,5. 1 重组DNA技术发展史上的重大事件 三大成就： 一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；,三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码

3、，阐明了遗传信息的流动与表达机制。,表5-1重组DNA技术史上的主要事件,限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。,图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。,图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体,体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组以后，还要将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子

4、克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都是基因导入的载体。,获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。,图5-3 重组DNA操作过程示意图,5. 2 DNA操作技术 5. 2. 1核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 琼脂，琼脂糖，聚丙烯酰胺，核酸，蛋白质？,基 本

5、 原 理 一种分子被放置到电场中，会以一定的速度移向适当的电极，把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。,生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷（电荷密度），因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙

6、的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强，越适合分离小分子量的分子。,表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺 501,图5-4 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图,5. 2.

7、 2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。,细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。 为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。,图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选,CaCl2法 将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透

8、性改变，易与外源DNA相粘附。 将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。 转化效率可达到51062107个转化子/g超螺旋质粒DNA。,电击法 电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。 将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（21010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。,获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm，时间跨度一般为4.55.5毫秒。 电击转化与温度有关，一般在04

9、进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素（常用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等）的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,利用噬菌体颗粒能够有效地将DNA注入到寄主细胞中这一特点，科学家又发明了重组体DNA分子的体外包装法。 经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌表面的噬菌体接受器位点将DNA注入受体细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。,图5-6 噬菌体作为克隆载体构建基因文库的流程图,5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术 聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。 PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomic PCR，若

10、是mRNA，反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。,PCR技术的原理 首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。,DNA解链（变性） 引物与模板DNA相结合（退火） DNA合成（链的延伸）三步。 经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。,将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。 降低反应温度（退火，约50），约1分钟，使寡

11、核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。 将反应混合物的温度上升到72左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按53方向延伸，合成新生DNA互补链。,图5-16 聚合酶链式反应示意图。（a）起始材料，双链DNA；（b）反应混合物加热后发生链分离，降温使引物结合到待扩增靶DNA区段两端的退火位点上；（c）Taq聚合酶以单链DNA为模板在引物的引导下利用反应混合物中的dNTPs合成互补的新链DNA；（d）将反应混合物再次加热，使旧链和新链分开；（e）合成新的互补链DNA；（f）重复b；（g）重复c、,图5-7 聚合酶

12、链式反应（PCR）技术,图5-8 PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较,5. 2. 4 实时定量PCR （real time quantitative PCR，Q-PCR） 由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR， 利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。,混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后，才能够被激发出荧光。 随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。 非序列特异性荧光染料SYBR Green I ,

13、 激发光波长520nm。,SYBR Green I作探针的实时定量PCR实验过程图示,为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。 TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5和3端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。,随着PCR反应的进行，TaqMan 探针结合到目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接

14、反映了所扩增靶DNA的总量。,TaqMan探针实时定量PCR技术,图5-11用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量。,Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。,5. 2. 5 基因组DNA文库构建 把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。,Clark和Carbon于1975年提出公式： N=ln(1-p) / ln(1-f) 式中：N表示一个基因组文库所应

15、该包含的重组克隆数目；p表示所期望的靶基因在文库中出现的概率；f表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组DNA总长的比值。 为获得整个基因簇或一个基因及其两翼延伸序列，基因组文库中的DNA片段常大于20kb。以人为例，其基因组大小为3109bp若p=99%，平均插入片段大小为20kb，则N=6.7105。,构建基因组文库最常用的是噬菌体载体（克隆能力约1520kb）和限制性内切酶部分消化法。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A，与BamHI是一对同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的噬菌体载体上。,图5-13 用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核

16、生物基因组DNA并利用噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。,此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。 它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。,5. 3 RNA基本操作技术 真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。,细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5g RNA, 其中80%-85%为rRNA、15%-20%为tRNA及sRNA，这些RNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是rRNA电泳后28S和18S特征性条带是鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。mRNA约占总RNA 的1%-5%。,图5-14 Poly