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1、,外源基因的表达,基因表达(gene expression): 结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有的加工过程。,根据表达目的基因的宿主选择不同，表达体系可以分为： 原核细胞表达体系 真核细胞表达体系,1、 原核细胞,大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 链霉菌,（1）大肠杆菌,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的优势：,全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架,基因克隆表达系统成熟完善,繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定,被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,大肠杆菌表达外源基因的劣势,缺乏对蛋白质的分泌信号,缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统,内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白,细胞周质内
2、含有种类繁多的内毒素,（可以通过构建表达体系解决),二、大肠杆菌体系中的基因表达,构建表达载体 使用特殊大肠杆菌宿主菌,（1）构建表达载体,通过表达载体产生目的蛋白的过程其实就是基因表达的整个过程，所以表达载体需要基因复制、转录、翻译所应具备的一系列特征。,基本构件,转录：启动子（可受调控的强启动子） 终止子（目的基因下游）,翻译：密码子 核糖体结合位点（SD序列）,复制：复制起点,附加构件（组建融合蛋白） 蛋白分泌信号 分离纯化信号,启动子 真核生物的基因不能被大肠杆菌RNA聚合酶所识别，所以要把真核基因放在原核生物强启动子下游。 在大肠杆菌中使用的强启动子，往往也是受调控的,持续地、高水平
3、地表达某一目的基因对于宿主细胞往往是有害的，因为这种表达会过分消耗宿主细胞的营养和能量； 使用可调控的强启动子使目的基因只在宿主细胞生活的某个阶段特定表达，而且只表达一段时间，有助于产生大量的蛋白并保持质粒的稳定。,常用的可调控的强启动子： 大肠杆菌的lac启动子 大肠杆菌的trp启动子 将lac的-10区和trp的-35区融合起来的tac启动子 噬菌体的左向启动子PL T7噬菌体启动子,开始转录,T T G A C A A A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol
4、辨认位点 (recognition site),-35 区序列,-10 区序列,PlL,Ptrp,Plac,PtraA,Ptac,启动子,T T G A C A,G A T A C T,T T G A C A,T T A A C T,T A G A C A,T A A T G T,T T T A C A,T A T A A T,T T G A C A,T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,P,乳糖启动子Plac的可控性：,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有
5、诱导物,存在时，整个操纵子处于基,基底水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高。实际操作中常用改造过的LacUV5启动子，这是强启动子。,大肠杆菌的lac启动子,没有乳糖存在时,阻遏蛋白的负性调节,可诱导的阻遏蛋白的负性调节,有乳糖存在时,Ptrp,色氨酸启动子Ptrp的可控性：,Otrp,除去色氨酸,色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏,蛋白复合物的阻遏，转录呈基底,状态。在培养系统中去除色氨酸,基底水平转录,或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），,便可有效地解除阻遏抑制作用。,在正常的细菌培养体系中，除去,色氨酸是困难的，因此基因工程,中往往添加IAA诱导Ptrp介
6、导的目,基因的表达，并且Ptrp是去除衰减子序列的启动子。,色氨酸,或加3-吲哚丙烯酸,高效转录,阻遏蛋白,（IAA）,Otrp,Ptrp,高效转录,Otrp,Ptrp,大肠杆菌的trp启动子,Trp 高时,Trp 低时,mRNA,P,RNA聚合酶,RNA聚合酶,?,色氨酸启动子负调控机制,色氨酸操纵子,大肠杆菌色氨酸操纵子的衰减作用的可能机制,C. 高浓度色氨酸使核糖体到达2部位， 3与4 碱基配对，转录终止。,A. 游离mRNA中1与2以及3与4碱基配对。,B. 低浓度色氨酸使核糖体停留在1部位，转录得以完成。,Trp 密码子,c) l噬菌体启动子,PlL的可控性：,噬菌体启动子PL受CI
7、阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋在42时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达。,d) T7启动子,T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。 强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细
8、胞总蛋白的50%以上。,T7噬菌体启动子,终止子,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶继续转录质粒上邻近的DNA序列； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；,终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。 两类终止子 使用不依赖因子的终止子 常见的是核糖体rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRN
9、A翻译的起始效率主要由其5端的结构核糖体结合位点（RBS） 所决定。,核糖体结合位点,核糖体结合位点特点对翻译的影响： Shine-Dalgarno（SD） SD序列与翻译起始密码子之间的距离 翻译起始密码子,SD序列是原核生物mRNA分子上一段富含嘌呤的序列，由49个碱基组成，一般位于起始密码子上游约813个核苷酸的位置，是一段高度保守的序列，以AGGA为核心。它可以和16SrRNA的3-端序列互补，可以使mRNA上位于SD序列下游的第一个AUG作为起始密码子，起始翻译。也叫做核蛋白体结合位点(ribosomal binding site, RBS),S-D序列 (Shine-Dalgarn
10、o sequence ),IF-3,IF-1,mRNA在小亚基定位结合,mRNA与小亚基的结合依赖于：,SD序列与16S rRNA 3端部分序列的互补,一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，一般SD序列至少含AGGAGG序列中4个碱基。对多数基因而言，上述碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低,SD序列与翻译起始密码子之间的距离,SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序
11、列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低,起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。 从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。,密码子,密码子偏爱性对外源基因表达的影响 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠
12、杆菌中的高效表达均采用了这种方法,常见的表达受体菌株,2、附加构件（组建融合蛋白）,蛋白分泌/保护信号 分离纯化信号,蛋白分泌/保护信号,外源蛋白，特别是相对分子质量较小的蛋白，在异源宿主细胞中的含量通常都很低，因为在大多数情况下，外源蛋白都会被宿主细胞降解，解决这一问题有两种办法。,将要表达的外源蛋白与一个宿主的蛋白共价连接，构成融合蛋白； 在外源基因前加入一段信号序列，将外源蛋白分泌到细胞周质外。,将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。 在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于
13、C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白,在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件,分离纯化信号,为了有效、简便地纯化在原核细胞中表达出的外源蛋白，方便下游的纯化工作，人们设计了各种融合蛋白的表达载体，即在外源蛋白的N端或C端加上标记物，利用标记物的某些特性进行亲和纯化。,目前应用较多的标记物有： 谷胱甘肽S-转移酶标记 6His
14、标记 Flag和HA标记 钙调蛋白结合蛋白标记,论述：影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的表达产量-单位体积产量-细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相关。细胞浓度与生长速率、外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在着一个动态平衡，只有保持最佳的动态平衡才能获得最高产量；单个细胞的产量又与外源基因的拷贝数、基因表达效率、表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。因此必须从以下因素入手，寻找提高外源基因表达效率的有效途径：,（1）外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接 相关。 （2）外源基因的表达效率：启动子的强弱，SD序列和 ATG的间距等。 A、启动子的强弱：目的基因插入表达载体启
15、动子的 下游，可增加基因的表达。lac、trp、 tac、 bla。 B、核糖体结合位点的有效性 C、SD与ATG的间距：影响非融合蛋白的合成水平 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆 菌“偏爱”的密码子；,（3）表达产物的稳定性：组建融合蛋白；利用信号肽； 特异性突变；宿主蛋白酶缺陷 （4）细胞的代谢负荷：拟制外源基因的表达；宿主细胞 的生长与重组质粒的复制分开； （5）工程菌的培养条件：host-Vector -cloning gene,举例：基因工程中常用的表达载体,pBV220系统 是国内使用较多的载体系统，由中国预防医学科学院病毒所构建。已经成功地用于表达IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-6、 IL-8 、-干扰素、-干扰素、TNF、G-CSF等多种细胞因子。,pBV220系统国内使用最多的载体,其组成: 来源于pUC8多克隆位点 核糖体rrnB基因终止信号 pBR322第42253735位 pUC18第2066680位 噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子 pRC23的PL启动子及SD序列,pBV220系统优点： cIts857抑制子基因PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。 SD序列紧跟多克隆位点
