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1、RNA干扰的应用以及小分子RNA的作用摘要：RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。siRNA即胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约2123 bp），具有介导mRNA切割的作用。miRNA是一种2024 nt的单链小分子RNA,它是一组不编码蛋白质的短序列RNA,本身不具有开放阅读框(ORF)。关键词：RNAi siRNA miRNA RNA一度被认为仅仅是DNA和
2、蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早先设想的更为重要。RNA干扰（RNA interference, RNAi）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，而随着对另一类小分子RNAmicroRNA(miRNA)的研究获得突破性进展,更使得RNA成为当今世界的研究热点之一.近几年来RNA干扰（RNA interference, RNAi）研究取得了突破性进展，被Science杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能
3、和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。1RNA干扰和siRNA1.1 RNAi是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。近年来，真核基因转录后关闭（沉寂）现象也得到了深入研究，对基因表达调控的机制的了解又有了新突破，其中最重大的是20世纪90年代后期明确的RNA干扰。科学工作者发现在利用反义RNA阻止对应mRNA翻译蛋白质时结果并不稳定，甚至有时正义RNA也能阻止mRNA翻译出蛋白质，这使得美国学者Fire和Mello猜想，可能阻止mRNA翻译的并不是有关的单链RNA而是其中混杂的痕量双链RNA，进一
4、步的实验证实只要少量的双链RNA就可干扰线虫对应基因的表达，而即使是大量的单链RNA（不管是反义还是正义的）并不起明显作用。其后明确这具有普遍意义：双链RNA是有效的基因关闭启动者。病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约2123 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA
5、诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进
6、一步放大，最终将靶mRNA完全降解。胡海燕等发现利用体外转录合成的siRNA可抑制A549和NCI-H460细胞bcl-2基因表达，抑制效率高达50%以上。1.2 RNAi具有的特征：、RNAi是转录后水平的基因沉默机制；RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；dsR
7、NA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Diecer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。1.3 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。在利用RNAi技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治
8、疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。目前国内外研究者用 RNA 干扰技术沉默 hTERT 的报道主要有： Song MS 等将含有 hTERT 的腺病毒载体转
9、入腹膜癌扩散的小鼠体内，发现hTERT的RNA 量下降 4 倍，血管发生与转移相关的基因和bcl-2基因的表达量下降；Canales BK 等在非雄激素依赖型的前列腺癌模型中发现转染癌细胞 50 天后，癌细胞生长被抑制、凋亡显著发生、端粒酶活性被抑制，且与siRNA的剂量成正比； Shammas MA 等用siRNA和质粒电穿孔转染 HeLa 细胞， 癌细胞的永生性被逆转、端粒酶活性降低、端粒长度下降、细胞群落变小、细胞生长停止。国内采用 RNA 干扰技术、 针对端粒酶的 hTERT基因的研究方法基本一致， 研究对象有肝癌、宫颈癌、神经胶质瘤、胃癌细胞等，结果均发现采用RNA干扰技术后癌细胞的
10、凋亡率明显升高、细胞生长受抑，提示该方法的在临床的广阔应用前景。2. snRNA、snoRNA和scRNA2.1 小分子核RNA（snRNA）是在真核细胞核内的一组小分子RNA它的分子较小，含约50-200个核苷酸，故称为小核RNA。它们与有关蛋白结合形成的小核糖核蛋白体（snRNP），主要在加工RNA前体，切除多余的片段（如内含子）时发挥重要作用。snRNA在核内转录，但snRNP在胞浆组装，发挥功能则又在核内，故需跨核膜转运。在核内snRNP可被识别真核有关RNA前体中的内含子的3个保守序列:：头（5端，多为GU起始）,尾(3端，多为AG结尾)和分支点（接近尾部，富含A），进而组成剪接复合
11、体进行准确的切除。典型剪接复合体由5种snRNP组成，每种snRNP均由一种snRNA（分别对应称U1、U2、U3、U4、U5和U6）与6至10个对应蛋白构成。2.2 小核仁RNA（snoRNA）是最早在核仁发现的小RNA，最初发现它们的生物功能是用来修饰rRNA的。大多数小核仁RNA可以分为两类。一类是C Dbox snoRNA，这一类snoRNA是对RNA的碱基进行甲基化修饰的。其特点是含有4个Box：Box C、Box D、BoxC和BoxD。事实上对C D box snoRNA的预测已经有很多已经发表的软件，比如说snoscan。另一类是H/ACA box，这一类snoRNA对RNA的
12、碱基进行甲尿嘧啶化修饰。其特点是形成一个双stem，中间加一个loop区，中间的loop区中有一个boxH。而在尾部的tail有个boxACA。由于boxH和boxACA的一级序列特征的界定比较松。比如BoxH是ANANNA，很多A rich的区域都能满足这个特征。而boxACA是ACANNN，只有3个碱基的明确信息。所以单单从一级序列特征上判断一个RNA是否为snoRNA是比较容易出错的。好在，HACA snoRNA的二级结构是非常明确的。所以，用二级结构结合尾部的Box ACA的特征，联合判断一个RNA是否为HACA snoRNA是切实可行的。snoRNA在细胞中的含量是比较高的，种类也比
13、较丰富，这些snoRNA基因的缺失并不导致细胞死亡甚至表形变化都难以观察到。现在看来，其修饰的不仅仅是rRNA，而且还包含了snRNA，mRNA等许多其他种类的RNA。它们的功能多样性正在逐渐被了解。2.3 小胞浆RNA（scRNA）长约300个核苷酸，又称为,7SL-RNA，主要存在于细胞浆中，对蛋白质定位合成于粗面内质网上有重要作用。早已了解到分泌性蛋白和膜蛋白是在内质网中合成，然后由囊泡转运的，后明确这与有关蛋白中有信号肽（序列）有关。20世纪80年代中期，在真核细胞中发现的scRNA使人们了解到了有关mRNA和核糖体定位到内质网膜上的机制：scRNA和有关蛋白共同组成一种复合物，此复合
14、物能特异地识别结合信号肽，故被称为信号识别体（signal recognition particle，SRP）；SRP不仅识别信号肽，并可与核糖体结合，暂时阻断多肽链的合成；它进一步可与粗面内质网膜上的SRP受体(也称码头蛋白)结合，介导核糖体和信号肽与膜上的核糖体结合蛋白及蛋白通道结合，核糖体定位于粗面内质网；随后SRP与受体解离并进入新的循环，而信号肽引导继续合成的蛋白序列进入内质网内腔。3. miRNA3.1 miRNA是一种2024 nt的单链小分子RNA,它是一组不编码蛋白质的短序列RNA,本身不具有开放阅读框(ORF)。成熟的miRNA 5端有1个磷酸基团,3端为羟基。3个研究小组
15、分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100多个新miRNA中,有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组,具有高度的保守性,在这些高度保守的片段中只有12个碱基的区别(如表1)。Lau和Bartel(miRNA的发现者之一)的同事认为：所有的miRNA可能在其他物种中都有直向同源物 (Orhtolog,指那些起源于同一祖先,在不同生物体中行使同一功能的基因群就可作为一个门类,这些类似的基因就称为“直向同源物”)。这种高度的保守性被科研人员认为与其功能的重要性有着密切的关系,同时也为生物早期进化的同源性提供了某种证据。3.2 目前认为,miRNA作用的可能机制是首先在dicer酶的参与下,将一个约
16、70 nt具有茎环结构的稳定前体加工成为一个稳定的双链RNA分子,然后迅速降解成为约22 nt的单链RNA分子,之后再被PPD(PAZ &piwi domain)蛋白质家族的成员识别结合,形成一个PNA-蛋白质复合体,即miRNA核蛋白前体(miRNP),进而形成成熟的miRNA以反义RNA的形式与靶基因3端UTR结合,引起翻译阻遏。在整个加工过程中,dicer酶的识别和加工需ATP供能,而后来PPD蛋白质家族的识别结合却不需要ATP供能。成熟的miRNA存在着与靶miRNA的3端非翻译区(UTR)互补配对的位点,两者识别结合,使翻译无法进行,从而抑制基因的表达。但也有研究结果表明,有些miRNA能与mRNA中的开放阅读框(ORF)结合,这种下调机制引起发育过程中某些特定蛋白质数量的急剧减少,从而成为下一个发育阶段的标志。3.3 目前对于miRNA的功能还有待深入研究,从已知的研究来看,它的主要作用是调节动植物的生长发育。
