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1、Western-Blot 操作流程 Western-Blot 操作流程 试剂配制 试剂配制 （一）母液 （一）母液 1.0mol/L TrisHCl1.0mol/L TrisHCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至所需点（见下所示） ，最后用蒸馏水定容至 250ml，高温灭菌后室 温下保存。 PH HCl 7.4 约 17ml 7.5 约 16m 7.6 约 15ml 8.0 约 10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇 100ml 溶
2、解后，分装于 1.5ml 离心管中，-20保存。 0.2mol/L NaH0.2mol/L NaH2 2POPO4 4 NaH2PO4（MW119.98） 12g 蒸馏水至 500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 0.2mol/LNa0.2mol/LNa2 2HPOHPO4 4 Na2HPO412H2O（MW 358.14） 71.6g 蒸馏水至 1000ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 10SDS 10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10过硫酸胺（AP） 10过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯
3、水 1.0ml 溶解后，4保存，保存时间为 1 周。 （可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在 EP 管中， 一次性多装几管， 使用时加入超纯水即可） 1.5mol/L TrisHCl（pH8.8）1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至 8.8，最后用超纯水定容至 250ml，室温下保存。 0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） 0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至 6.8，最后用超纯
4、水定容至 250ml，室温下保存。 40Acr/Bic（37.5：1）40Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g 甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g 超纯水至 100ml 溶解后 4保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 20Tween20 20Tween20 Tween20 20ml 蒸馏水至 100ml 混匀后 4保存。 （二）使用液 （二）使用液 单去污剂裂解液（PMSF） ：单去污剂裂解液（PMSF） ： 1mol/L TrisHCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX-100 0.5ml 蒸馏水至 50ml 混匀后 4保存。使用时，加入 P
5、MSF 至终浓度为 100g/ml（0.87ml 裂解液加入 1.74mg/ml PMSF50l） 。 （一般实际用的比较多的其实是 RIPA 裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。至于其中每个要加多 少量那就自己去算吧，因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了） 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO4 19ml 0.2 mol/L Na2HPO4 8
6、1ml NaCl 17g 蒸馏水至 2000ml （如果用 TBST 进行洗膜的话，其实 PBS 用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买 20 的 PBS 浓缩液即可，500ml 的浓缩液不到 50 元，很方便） G250 考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） G250 考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） 考马斯亮蓝 G250 100mg 95乙醇 50ml 磷酸 100ml 蒸馏水至 1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保存。 0.15 mol/L NaCl 0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸馏水至 10
7、0 ml 高温灭菌后，室温保存。 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml 溶解后-20保存。制作蛋白标准曲线时，用 0.15 mol/L NaCl 进行 100 倍稀释成 1mg/ml， -20保存。 10分离胶和 4浓缩校 10分离胶和 4浓缩校 10分离胶（两块胶，10ml） 4浓缩胶（两块胶，5ml） 超纯水 4.85ml 3.16ml 40Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml 1.5 mol/L TrisHCl（pH8.8） 2.5ml 0.5 mol/L TrisHC
8、l（pH6.8） 1.26ml 10SDS 100 l 50 l 10%AP（过硫酸胺） 50 l 25 l TEMED 5 l 5 l 加 TEMED 后，立即混匀即可灌胶。 （为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和 TEMED 量加大，一般加至原来的 2-3 倍，根据实验当时 的温度适当调整） 还原型 5XSDS 上样缓冲液还原型 5XSDS 上样缓冲液 0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g SDS 0.5g 溴酚蓝 0.025 甘油 2.5ml 混匀后，分装于 1.5ml 离心管中，4保存。 电泳液缓冲液电泳液缓冲液 Tr
9、is（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用 35 次。 （电泳液可以回收重复利用， 一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分， 上半部分最 好使用新鲜的电泳缓冲液） （可以配制成 10电泳液缓冲液进行保存，稀释 10 倍使用） 转移缓冲液 转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g Tris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用 35 次（次溶液最好保存在 4 度冰箱，最多使用 5 次 左右，不然
10、影响转移效率） 。 （先用蒸馏水溶解甘氨酸、 Tris 和 SDS， 然后再加入甲醇， 最后补足液体。 如果先加入甲醇， 溶解甘氨酸、Tris 和 SDS 等比较困难） （可以配制成 2转移缓冲液进行保存，稀释后使用） 10X 丽春红染液 10X 丽春红染液 丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 蒸馏水至 100ml 使用时将其稀释 10 倍。 TBS 缓冲液 TBS 缓冲液 1 mol/L TrisHCl（pH7.5） 10ml NaCl 8.8g 蒸馏水至 1000ml （可以配制成 10TBS 缓冲液进行保存，稀释 10 倍使用） TBST 缓冲液 TBST 缓冲液 2
11、0Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，最好现用现配。 封闭液 封闭液 脱脂奶粉（国产，光明牌） 5g TBST 100ml 最好现用现配。 洗脱抗体缓冲液 洗脱抗体缓冲液 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巯基乙醇) 700 l（通风厨里加） SDS 2g 0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） 12.5ml 超纯水至 100ml 配制时，在通风厨内进行。4保存。可重复使用 1 次。 （可用可不用） 显影液（5X）显影液（5X） 自来水（加热至 50） 375ml （以下药品加到温水中） 米吐尔 1.55g 亚硫酸钠（无水） 2
12、2.5g 碳酸钠（无水） 33.75g 溴化钾 20.95g 补水至 500ml 配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4保存。使用时 用自来水稀释至 1 倍。 （不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买 即可，很便宜，一包 5 毛钱左右） 定影液 定影液 自来水（5060） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者） 硫代硫酸钠 240g 亚硫酸钠（无水） 15g 冰乙酸 12.6ml 硼酸 7.5g 钾明矾 15g（水温冷至 30以下时再加入） 加水定容至 1000ml，室温保存。 （不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买 即可，很便宜，一包 5 毛钱左右） 抗体抗体 用 TBST 稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便宜，可以多 买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交 袋的完整性） 。 化学发光试剂化学发光试剂 分 A 和 B 两种试剂，有钱可以购买 Amersham、Pierce 或者 Santa Cruz 的， 没钱的话碧云天的 ECL 也能凑合。 操作步骤 操作步骤 （一） 蛋白样品制备 （一） 蛋白样品制备 （1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸
