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1、基因工程制药基因工程制药基因工程制药基因工程制药(一)概述(二)基因工程药物生产的基本过程(三)目的基因的获得(四)基因表达(五)基因工程菌的稳定性(六)基因工程菌生长代谢的特点(七)基因工程菌发酵(八)基因工程药物的分离纯化(九)基因工程药物的质量控制(十)基因工程药物制造实例?表达系统表达系统表达系统表达系统：一个完整的表达系统通常包括配套的表达表达表达表达载体和表达菌株载体和表达菌株载体和表达菌株载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。?表达载体表达载体表达载体表达载体：包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），
2、复制子，筛选标记/报告基因等。表达菌株：不同的表达载体对应有不同的表达菌株。?组成型表达组成型表达组成型表达组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。这类表达载体通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。?诱导型表达诱导型表达诱导型表达诱导型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于解决有毒蛋白或者过量表达对细胞的影响。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。?融合表达融合表达融合表达融合表达：表达载体的多克隆位点上有一
3、段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。?分泌表达分泌表达分泌表达分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。?可溶性表达可溶性表达可溶性表达可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及
4、折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。(五)基因工程菌的稳定性传代过程中常出现质粒不稳定的现象?分裂不稳定:工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象（常见）。?结构不稳定:外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。一、质粒不稳定产生的原因1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率2.这两种菌的生长比速率差异的大小对同一工程菌，通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的拷贝数：?含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性?含高拷
5、贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对质粒的稳定性不利?受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解?外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序?重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配?受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制载体的选择遗传特性宿主的选择外源基因整合到宿主染色体上培养基生长速率发酵工艺限制性基质温度p
6、H和溶氧外源基因表达影响基因工程菌稳定性的因素无抗性平板无抗性平板无抗性平板无抗性平板无抗性平板无抗性平板无抗性平板无抗性平板工程菌培养液工程菌培养液工程菌培养液工程菌培养液工程菌培养液工程菌培养液工程菌培养液工程菌培养液质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法抗性平板抗性平板抗性平板抗性平板抗性平板抗性平板抗性平板抗性平板稀释稀释稀释稀释稀释稀释稀释稀释涂布涂布涂布涂布涂布涂布涂布涂布培养培养培养培养培养培养培养培养1010101010101010-1212121212121212hhhhhhhh随机挑选随机挑选随机挑选随机挑选随机挑选随机挑选随机挑选
7、随机挑选100100个菌落个菌落个菌落个菌落个菌落个菌落个菌落个菌落1010101010101010-1212121212121212hhhhhhhh菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数稳定性(ST,stability)?两阶段培养法:第一阶段先使菌体生长至一定密度第二阶段诱导外源基因的表达减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别?选择性压力：如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长?环境参数调控（温度、PH、培养基组分和溶解氧浓度）二、提高质粒稳定性的方法?将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞?正确设置载体上的多克隆位点禁止
8、DNA片段插在稳定区内?将受体细胞的致死性基因安装在载体上?同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合蛋白编码基因）改进载体受体系统?根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力?载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂，成本较高施加选择压力?有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供
9、氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。?培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定?培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定优化基因工程菌的培养工艺(六)基因工程菌生长代谢的特点?菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率来表示。?工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料或稀释速率等方法来控制菌体的生长。?控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率都有重要意义。对菌体生长的调控主要有两种观点：?一种认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率?另一种认为是小分子前体和催化组分等的限制决定了菌体的最大比生长速率?碳
10、源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用。一、菌体生长与能量的关系?分批培养中选择不同的碳源，补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。?加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。?大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。?采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高
11、产量。?菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低?基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构中等拷贝质粒数：相关酶的相对水平增加高拷贝质粒数：前体不足，严紧反应二、菌体生长与前体供应的关系?“严紧反应”：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，并合成称为“魔点”的ppGpp的结果。?ppGpp：一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延深过程减少转录。?其浓度的增加导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降
12、低，严紧控制的启动子的转录减少。(七)基因工程菌发酵(1)通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；(2)通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序基因工程菌的培养过程菌种菌种菌种菌种一级种子摇瓶一级种子摇瓶一级种子摇瓶一级种子摇瓶二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养原料原料原料原料发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养灭菌灭菌灭菌灭菌发酵生产发酵生产发酵生产发酵生产代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离基配制基配制基配制基配制菌种菌种菌种菌种一级种子摇瓶一
13、级种子摇瓶一级种子摇瓶一级种子摇瓶二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养原料原料原料原料发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养灭菌灭菌灭菌灭菌发酵生产发酵生产发酵生产发酵生产代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离基配制基配制基配制基配制微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图1.补料分批培养2.连续培养3.透析培养4.固定化培养一、基因工程菌的培养方式1111、补料分批培养补料分批培养补料分批培养补料分批培养将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一
14、步生长的培养方式。?为保持基因工程菌生长所需的良好环境，延长对数生长期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和补料措施结合起来，根据生长规律来调节补料速率。2222、连续培养连续培养连续培养连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。?基因工程菌的两阶段连续培养:工程菌的生长阶段基因的表达阶段?关键控制参数：诱导水平、稀释率、细胞比生长速率3、透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。?膜透析装置4、固定化培养?维持质粒的稳定性?基因工程菌固定化后，质粒的稳定性大大提高。便
15、于进行连续培养，特别是对于分泌型菌更为有利。二、基因工程菌的发酵工艺获得微生物自身基因表达所产生的初级或次级代谢产物获得大量外源基因表达产物生产目的不含外源基因带外源基因重组载体生物材料(微生物)传统微生物发酵基因工程菌发酵基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有：培养基的影响接种量的影响温度的影响溶解氧的影响诱导时机的影响pH的影响1、培养基的影响提高工程菌生长速率，保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达?常用碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等葡萄糖做碳源菌体产生的副产物较多，对lac启动子有阻
16、遏作用；甘油做碳源菌体得率较大?常用的氮源:酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等酪蛋白水解物做氮源有利于产物的合成与分泌?其他：无机盐、微量元素、维生素、生物素等无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。?接种量：移入的种子液体和培养液体积的比例。?接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度，影响发酵的产量和发酵周期接种量小：生长延迟期较长，不利于外源基因的表达接种量大：缩短生长延迟期，减少污染机会接种量过高：代谢产物累积过多，抑制后期菌体的生长2、接种量的影响3、温度的影响?温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上复制水平：通过调控复制，改变基因拷贝数转录水平：影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶mRNA降解和翻译水平细胞内小分子调节分子的量影响细胞内ppGpp量?影响蛋白质的活性和包含体的形成4、溶解氧的影响?影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大?外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的
