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1、,肿瘤细胞的培养,一、肿瘤细胞培养技术二、肿瘤细胞的培养三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输五、总结,一、肿瘤细胞培养技术,1、取材,肿瘤细胞培养材料主要来源于外科手术或活检的瘤组织。取材部位非常重要体积较大的肿瘤组织中央常有退变或坏死区，取材时应去掉坏死组织，故应去瘤体的周围瘤组织做培养，癌性转移的淋巴结或癌性胸腹水是较好的培养材料。取材后应尽快进行培养，如因故不能立即培养，可按正常组织储存方法保存，将组织剪成1mm3左右的小块，放入培养液中，置4保存，但存放时间不宜超过24h。取材时应注意无菌操作。,类固醇细胞瘤,一、肿瘤细胞培养技术,2、分离,培养液中1mm3的
2、组织块，仅有少量处于周围的细胞可能生存和生长。若要获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。目前分散组织的方法有机械和化学两种，要根据组织种类所需和培养要求，采用适宜的手段。机械法：机械分散发、剪切分离法消化分离法：胰蛋白酶消化法、胶原酶法,一、肿瘤细胞培养技术,2、分离,剪切分离法:在进行组织块移植培养时，可以采用剪切发，即将组织剪或切成小块然后分离培养。步骤：1、首先将经修整和冲洗过的组织块放入小烧杯中，用剪刀反复剪切组织至似糊状。2、用吸管吸取缓冲液或无血清培养液加入烧杯中，反复轻轻吹打，低速离心去上清剩下的组织小块即可用于培养。,一、肿瘤细胞培养技术,2、分离,胰蛋白酶消
3、化法：适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝等组织。对传代细胞效果也很好，胰蛋白酶消化效果主要与PH值、温度、浓度、组织块大小和硬度有关。,1、将组织块剪切成12mm32、加入胰蛋白酶37热消化3、过筛200目4、必要时重复5、加入胰蛋白酶冷消化6-24h6、沉淀去上清7、加新的胰蛋白酶37消化30min8、过筛9、离心去上清10、加入血清培养基吹打11、计数12、接种瓶培养,热消化,冷消化,共同步骤,一、肿瘤细胞培养技术,2、分离,二、肿瘤细胞的培养,1、原代培养,我们为何要进行原代培养？1、建立各种细胞系的第一步2、是获取细胞的主要手段3、组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生大变
4、化4、最接近和反映体内生长特性，适合做药物测试、细胞分化等试验原代培养方法有组织块法、消化培养法、器官培养法等。最基本和最常用的是组织块法和消化培养法。,二、肿瘤细胞的培养,1、原代培养,组织块培养法是一种简便易行且成功率较高的常用原代培养方法。即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理。例如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长，涂以多聚赖氨酸培养需旺细胞等，适用于组织量少的原代培养。,1、取材修剪冲洗2、剪成1mm3小块3、移入培养瓶4、分布组织小块间距5cm5、翻转培养瓶并加入适量培养液，37静置2-4h6、翻正培养瓶进行培养7、原代细胞生长,二、肿
5、瘤细胞的培养,1、原代培养,这种方法采用前述的组织消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸收养分和排出代谢产物，可以很快得到大量活细胞，细胞也可能在短时间内生长成片。适用于培养大量组织，原代细胞产量高；但步骤繁琐、易污染，一些消化酶价格昂贵，实验成本高。步骤：1、按消化分离法收获细胞。2、待组织已分散成细胞团或单个细胞，则终止消化，过筛200目过掉组织块，大块组织继续消化。3、收集过滤消化液离心1000rpm/min，5min，去上清加含血清培养液，轻轻吹打形成细胞悬液，计数后接种到培养瓶，置CO2培养箱培养。,二、肿瘤细胞的培养,1、原代培
6、养,器官培养是指从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离，保持其原有器官的结构和连接，直接将器官或器官的一部分在体外培养，在培养过程中保持器官或其一部分组织的结构和功能。器官培养主要强调器官组织的相对完整性，重点观察细胞正常联系和排列情况下，它们之间的相互影响，和局部环境的失物调节作用等。,二、肿瘤细胞的培养,2、传代培养,肿瘤细胞的传代是人们利用培养肿瘤细胞作为进一步研究的靶材料。细胞性状的好坏直接影响研究的结果。常见肿瘤细胞的传代多指细胞系的传代，大致分为两种：一种是贴壁型细胞传代；另一种是悬浮型细胞传代。注意事项：1、细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于传
7、代。2、不同的细胞有不同的消化时间，因而要根据需要注意观察及时处理。3、吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。4、首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞尽可能适应新环境利于细胞生存和增殖。,二、肿瘤细胞的培养,2、传代培养,1、贴壁型细胞的传代步骤：1、选取生长良好的细胞一瓶，轻轻摇晃培养瓶，倒掉培养液，缓冲液洗一遍。2、从无细胞侧加入0.25%的胰蛋白酶，翻转培养瓶，使消化液浸没细胞1min左右。3、翻转培养瓶，放置5-10min，观察细胞出现布纹孔状为止。4、倒掉消化液。5、沿细胞面加入适量生长液,洗下细胞，吹散，按1:2或1:3传代培养。6、37培养，接种后30min可贴壁。48h
8、换液一次，3-4d形成单层细胞。,二、肿瘤细胞的培养,2、传代培养,CHO贴壁细胞,开始培养48h形成致密单层,二、肿瘤细胞的培养,2、传代培养,加入0.25%胰酶,皱缩边缘、间隙增大、不再致密,二、肿瘤细胞的培养,2、传代培养,基本皱缩变圆完全皱缩变圆，弃去胰酶，将细胞洗下,二、肿瘤细胞的培养,2、传代培养,2、悬浮型细胞传代步骤：1、选取生长良好的细胞一瓶，轻轻加入适量生长液。2、用无菌吸管轻轻吹打，使细胞悬浮，吸出一半的细胞悬液，加入到新的培养瓶中。3、37，5%CO2培养箱中培养24-48h。4、如细胞浓度较高，可按1:3进行传代。,三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测,1、目的,一旦培养
9、的肿瘤细胞生长成为形态单一的细胞群体后，不论是用于短期实验研究，还是用于建立细胞系，都需要进行一系列的细胞生物学鉴定。其目的在于：1、证明培养细胞是否来自原来的肿瘤细胞：2、说明肿瘤组织类型；3、描述肿瘤细胞的生物学特性。,三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测,2、检查项目,1、组织起源：对培养材料应说明起源于哪个胚层，什么器官的何种组织；来源于什么样的供体，患有何种疾病，辅助鉴别细胞的来源。2、形态学观察：细胞一般形态，如细胞形状、核浆比例、染色质和核仁大小及多少，以及细胞骨架的排列等。培养底细胞多呈多角形大小异型性明显，核浆比例倒置有丰富的三极或多极有丝分裂，核仁清晰、多个，微丝、微管排列紊乱
10、等。,人成骨肉瘤细胞人白血病细胞,三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测,2、检查项目,细胞生长特征：检测细胞生长曲线、细胞核分裂指数、倍增时间以及细胞周期等。癌细胞失去正常的接触抑制，细胞呈多层生长，细胞倍增时间较短，细胞生长密度增加，细胞核分裂指数较高，并具有无限增殖能力，细胞侵袭能力较强等特性。,细胞生长曲线,三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测,2、检查项目,软琼脂培养：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。步骤：1、制备1
11、.2%和0.7%浓度的琼脂糖溶液，灭菌备用。2、制备20%FBS+2x1640+2xPS营养液。3、铺下胶：1:1混合1.2%与营养液，混匀，凝固，备用。4、铺上胶：1:1混合0.7%与营养液，加入细胞悬液，混匀铺到下胶上，凝固后培养箱培养，10-14d。,三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测,2、检查项目,细胞核型分析：检测核型特点、染色体数量、有无标记染色体、染色体带型等。癌细胞染色体数日和结构异常，大多为异倍体，并可出现异常的标记染色体。,一个癌细胞的染色体共104条，包括许多异常的染色体,三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测,2、检查项目,动物致瘤试验：用(120)x106个mL细胞密度癌细胞
12、悬液接种裸鼠背部皮下，能够生长成为实体瘤，其组织学形态与原发肿瘤相似。,Balb/c裸鼠体内的干细胞致瘤实验,四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输,1、冻存,细胞冻存是指将细胞混悬于冻存液中，以一定的冷冻速度将细胞悬液降至-70以下，常于-196的液氮罐中长期保存。细胞冻存可保持传代细胞某些性质的相对稳定，同时也减少了长期传代中支原体等微生物污染的机会。原理：向将要冻存的细胞中加入陈存液，内含10甘油或二甲亚矾，可降低冰点，减少细胞内外冰晶的形成，从而降低了细胞在冻存过程中的损伤程度。细胞可在-70以下冰箱或液氮罐中长期保存。,四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输,1、冻存,方法1、选用指数生长期的细胞，
13、在冻存细胞前1d换液1次。2、贴壁细胞需用常规方法将细胞消化下来，制备成单细胞悬液。收集单细胞悬液，然后离心(1000r/min，离心5min)。3、弃上清，用冻存液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度至(110)x106/ml。4、将细胞悬液按冻存管大小分装(0.5-1.5ml/管)，扭紧管盟，注明细胞名称和冻存日期。5、将上述冻存管在4下放置30min，然后将冻存管移人-80超低温冰箱或液氮中保存。6、为保持细胞最大存活率，般采用逐渐降温的方法，标准冷冻速为-2-1/min，当温度达到-25时下降速率可加速至-10-5/min，到-100可迅速放入液氮罐中。,四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输,1、冻存
14、,细胞冻存步骤,四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输,2、复苏,细胞复苏指按一定的复温速度将冻存的细胞恢复到常温。当恢复到常温状态时，冻存细胞的形态结构保持正常，代谢反应即可恢复。方法：1、取出冻存管，立即放入37-40水浴锅中，快速摇晃直至完全融化(应在1min内完成)。2、离心细胞(1000r/min，5min)后，弃上清。用少量生长液悬浮细胞，转入培养瓶中配成所需要的细胞浓度，培养箱培养。3、无菌操作打开冻存管，将细胞悬液吸到培养瓶中，补足生长液后，置5CO237)培养箱中培养。46h后，待细胞贴壁，轻轻倒掉含冻存液的生长液，换生长液后继续培养。,四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输,2、复苏,细胞
15、冻存、复苏步骤,注意事项：1、应在1min内使冻存细胞完全融化，复温速度太慢会造成细胞损伤。2、复苏过程中应戴手套和护目镜。冻存管可能涌入液氮，解冻时冻存管内的气温急剧上升，可导致爆炸，应予以注意。,四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输,3、运输,在购买和交换培养细胞时，需根据保存方式和运输时间，采用适当的运输方法。1、充液法运输：选生长良好的细胞，待接近或刚刚连接成片后，去掉培养液，加入新鲜培养液至培养瓶颈部(保留少量空气)，拧紧瓶盖，然后用封口膜将瓶口密封。到达目的地后，弃去多余培养液，置37培养，次日传代。2、冰瓶运输：在较短时间内运输细胞，可将未冷冻的细胞悬液放入装有碎冰的冰瓶内，以保持细胞活力。3、液氮罐运输：细胞冻存后，将有细胞的冻存管放人液氮罐内进行运输。在液氮罐搬运过程中，要防止液氮外漏。,五、总结,肿瘤细胞培养步骤大体上可以分为分离、培养、鉴定以后根据后期用处决定用于冻存还是继续培养。然而肿瘤细胞又分为贴壁跟悬浮两种状态，两种状态得细胞所处理方法不一样每种细胞的培养方法所加试剂因子也不尽相同，如果需要精通各种肿瘤细胞的培养，不仅需要丰厚的理论知识，还有更丰富的实际操作经验。,
