《鸭坦布苏病毒病防治关键技术研究及应用2》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鸭坦布苏病毒病防治关键技术研究及应用2（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三章 材料与方法1 材料1.1实验动物及病料来源病原分离鉴定所需要病料来源为丰城、宜丰发病鸭场无菌采集的组织病料。病毒人工感染实验、病毒传播实验中所需实验鸭采购南昌县本地产蛋高峰期的南昌麻鸭（120只）；病毒防治试验中所需实验鸭采购宜丰县石市镇某鸭场蛋高峰期的初产种麻鸭（240只）。1.2主要试剂病毒RNA提取试剂盒、RT-PCR扩增试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。细胞培养基RPMI- 1640培养基、DMEM培养基（购于上海雷布斯网络科技有限公司）。LA-TAq酶以及限制性内切酶（购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；T4连接酶（购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；胶回收试剂盒
2、（购于广州捷倍斯生物科技有限公司）；基因组试剂盒（购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司）;过氧化氢、无水乙醇（国药生产）。1.3菌株与细胞试验种病毒复制、攻毒所用菌株为宜丰发病鸭场采集病料，由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室分离、鉴定、保存。病毒培养所需细胞购于上海雷布斯网络科技有限公司。SPF鸡胚，购于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。1.4常用试剂及缓冲液配制0.01mol/L PBS（pH 7.34）：称量1.44g的Na2HPO4，0.2g的KCl，0.24g的KH2PO4，8 g的NaCl溶解到单蒸水中，定容至1000 mL。胰酶（0.25%胰酶，0.025%EDTA、脂质体
3、（LiPS 2,000，天根生物）、转染培养基opti-mem（购于上海雷布斯网络科技有限公司），Western及IP细胞裂解液、碘化丙啶（PI）染色（购于上海朝瑞生物科技有限公司），枸橼酸钠缓冲液（枸橼酸100mg，0.1%Trionx-100 0.5 mL，生理盐水65mL，调pH7.2后用ddH2O定容至100 mL），PI 工作浓度50g/ mL，RNase酶工作浓度50g/ mL，可于试验前用缓冲液稀释使用。1.5主要仪器恒温振荡培养箱（购于上海高致精密仪器有限公司）；立式高压灭菌锅（购于河南省三强医疗器械有限责任公司）；紫外凝胶成像系统（购于大连美仑生物技术有限公司）；恒温水浴锅（
4、东莞博之远生物科技发展有限公司）；低速离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；高速离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；超声波破碎仪（美国生命科学公司）；酶标仪（美国AWARENESS酶标仪）；CO2细胞培养箱（购于上海姚氏仪器设备厂），PCR仪（购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司）等。1.6分析软件及说明引物设计软件：Primer Premier 6. 0 ；基因测序比对软件：Lasergene v 7.1中的SeqMan软件，RDP3(Recombination Detection Program)软件,Jameson-Wolf,MEGA 5.1 软件包中的NJ（Neighbor-J
5、oining 方法）。研究数据处理与分析：Microsoft office excel 2010。2病原分离鉴定实验2.1样品采集2.1.1 样品背景调查实验用于病毒分离鉴定的样品为丰城市、宜丰县鸭场样品，样品的背景调查情况如下:2013年，某防疫机构选取丰城市某蛋鸭养殖密集区域，该区域大多数人从事蛋鸭养殖，通过现场调查发现，2013年9-10月，鸭坦布苏病毒病在该区域曾在部分养殖场散发，到2013年底，产蛋率又逐渐恢复，现场实地调查2家蛋鸭养殖场，其中一家蛋鸭养殖场存笼蛋鸭8000多羽，在2013年2月份出现蛋鸭产蛋率突然下降，最低时降至10%左右，经过40多天后，产蛋逐渐恢复，死亡率约10
6、；另外一家蛋鸭养殖场存笼蛋鸭3000多羽，在2013年9月份开始发病，产蛋率下降至25%，经过35天后，产蛋逐渐恢复，死亡率5%左右。两家养鸭场的免疫程序为：20日龄免疫一次（H5+H9）禽流感疫苗，100日龄免疫（H5+H9）禽流感、大肠杆菌和鸭瘟三种疫苗。因此初步判定造成丰城市该区域蛋鸭产蛋下降的主要原因，可能为鸭坦布苏病毒病。2014年年初，某防疫机构选取宜丰县某蛋鸭养殖密集区域的4家规模蛋鸭场，进行流行病学调查，调查发现2013年年底出现减蛋症的有3家，现场实地采样调查了2家。其中一家蛋鸭养殖场存笼蛋鸭约1000羽，2013年4月份购买鸭苗，17日龄、200日龄分别两次免疫禽流感（H5
7、N1）疫苗，发生疫情前产蛋率可达98%，在2013年11月底开始出现产蛋骤减的问题，直至产蛋率下降至10%以下，该场防疫条件尚可，天然屏障较好，产蛋鸭除产蛋率下降外，采食量等没有明显改变，没有发现其他病理性临床症状。另外一家蛋鸭养殖场存笼蛋鸭约1400羽，85日龄免疫禽流感（H5N1）疫苗。2013年7月份购买鸭苗，11月底开产，按正常日龄推算，到2014年年初产蛋率应达到80%以上，但实际上仅日产鸭蛋10多枚，产蛋率1%左右，该场蛋鸭采食量等没有明显改变，没有发现其他病理性临床症状。剖检可见卵巢萎缩，蛋仔均如珍珠般大小且透明；肠道鼓起，拉白色稀便；脑部有轻度脑萎缩现象。综合调查发现，蛋鸭产蛋
8、率骤然下降在初次开产和产蛋高峰期蛋鸭易发，在饲养管理、防疫条件相对较好的养殖场蛋鸭继发感染少，蛋鸭死亡率明显减少。通过临床症状等情况综合分析，初步认为可能是由鸭坦布苏病毒感染所致，但确诊需进一步做实验室诊断。2.1.2 样品采集无菌采集丰城、宜丰两地各一蛋鸭场蛋鸭的卵巢、脑等，加入3倍体积等渗PBS（含1000 U青霉素和链霉素）进行匀浆，制成混悬液，样品处理后保存于-80备用。2.2病原分离2.2.1病毒提取分离将自2个鸭场采集的8份研磨处理的病料样品（FC1-FC4和YF1-YF4）反复冻融3次，8000 rmin-1离心5min，吸取上清液，用0.22 mol/L一次性滤器过滤除菌后，将
9、滤液接种于接种于10日龄SPF鸡胚，每枚胚接种0.2 mL，接种10日龄SPF鸡胚，接种后鸡胚3 d开始出现死亡，5 d后5枚SPF鸡胚中死亡3枚，收取所有样品鸡胚尿囊液.2.2.2引物设计参照GenBank 上已发表的DTMUV基因组序列：MM1775株(AB110494)、BYD-1株(JQ920420)、FJMH220株（JQ928189）、JS804株（JF895923）、YY5株(JF270480)，运用Primer Premier 6. 0 软件，设计出全基因组序列共8对引物，扩增的片段之间有重叠的序列，引物序列见表1，送上海生工生物工程有限公司合成。表1病毒全基因组扩增引物序列引
10、物名称引物序列（5-3）上游下游ATVP1/R1AGAAGTTCATCTGTGTGATAGAATTGCCCCATGTCAACATVP2/R 2GTCCCGTCTACACCGCTGATCACTGTGCACAGCTCTATTATVP3/R 3GTTGTCCACAAAGGTATTGGTTGTCATCCAGTAACCTATVP4/R 4GTGTTTGGGCCTTTCGAACTCTGAGTAGTGGTATTCATCTATVP5/R5GATGGAGAAGGAAGCGTGCAACCTCAATTAGTGTCACCGAAATVP6/R 6CACCAAATACGCTAACCTTGATGTTGTAAATGCAGGT
11、CTCAATVP7/R 7GACAGAGAAAGAGAACTGCATCCATGGATTGACCACGTTGATVP8/R 8GAGGAAGTCAGGCCAGGGAAAGATCCTGTGTTCTACCA注：R= A/G;Y= C/T;2.2.3病毒RNA提取及第一链合成将已鉴定为DHAV-1阳性的鸡胚尿囊液参照病毒RNA提取试剂盒的操作说明进行病毒基因组RNA提取，随后按照AMV反转录酶说明书进行病毒基因组cDNA第一链的合成，反转录条件为：4260min, 80 5min，反应结束后将cDNA置于-20保存备用。2.2.4全基因扩增与克隆反应体系为50uL，在0.2mLPCR管中依次加入5Fa
12、st Pfu Buffer 10uL，dNTPs(10 mM) 1uL，上/下游引物(20 pmol/uL)各1ul，cDNA 2uL，Fast Pfu DNA聚合酶(5u/uL) 1 uL，ddH2O至50uL。反应条件为：94预变性3min;然后9430s，50-5430s， 72 2min30s，35个循环; 72延伸，7 min，10结束反应。取 5uL PCR产物在1% 琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。将8个片段纯化回收后，参照pEASY-B载体操作说明进行克隆，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。2.3基因测序通过RT-PCR 扩增出病毒YF株基因组的8个基因片段，琼脂凝
13、胶电泳检测，片段大小与预测基本相符，结果见图1。扩增片段经1%琼脂凝胶纯化回收后，克隆到pEASY-B载体中，随后每个片段挑选3个阳性克隆送生物技术公司测序。3病毒复制试验3.1病毒增殖培养将省宜丰县蛋鸭场分离到的鸭坦布苏病毒YF毒株，接种于日龄SPF鸡胚传代培养，每天进行早上、中午和晚上共计三次照胚，将接种病毒后24内死亡的鸡胚去掉，在无菌条件下收集24h以外死亡鸡胚的尿囊液，尿囊液的收集不要在鸡胚死亡后立马收集，要在死亡后反复冻融两次后再收集，收集时间为7天，然后将收集的尿囊液放入20备用。3.2病毒含量测定 本实验鸭坦布苏病毒的含量通过ELD50测定来确定。具体操作方式为，在无菌条件下，
14、将收集的SPF鸡胚尿囊液经无菌检测后用PBS液进行10倍递增梯度稀释，稀释度设置为五个梯度，即浓度依次为100（尿囊原液）和10、10、10、10-4、10-5这五个浓度。将制作好的五个稀释度尿囊液依次接种于SPF鸡胚的尿囊腔，操作要控制在无菌条件下进行，每个稀释度接种枚10日龄SPF鸡胚，每个SPF鸡胚接种0.1ml。接种后鸡胚置于37条件下孵化120h，观察记录接种后120h内的鸡胚死亡情况，并按ReedMuench法计算鸭坦布苏病毒YF毒株的ELD50。距离比（大于50的百分数50）（大于50的百分数小于50的百分数）ELD50高于50的病毒稀释度的对数距离比稀释的对数。3.3实验分组及
15、攻毒实验分为三组（A组、B组、C组）每组蛋鸭40只，具体攻毒种类及方式如下：A组：胸肌肌肉注射注射鸭坦布苏病毒悬液，1ml/只；B组：胸肌肌肉注射注射等量生理盐水；C组：空白对照，不注射任何试剂。3.4攻毒效果评价在病毒复制实验开始前，要求麻鸭需做好常规鸭病疫苗免疫接种且为产蛋高峰期，选购后在试验场地饲养一周，待蛋鸭适应环境正常产蛋后开始进行病毒人工感染试验。实验开始过程中三组蛋鸭之间严格隔离，饲养员严格执行生物安全措施，防止交叉感染影响试验结果。从试验开始后每天仔细观察各组情况并做好产蛋量、发病情况等详细记录。实验中级实验结束后，进行临床症状观察、病理组织解剖，最终取组织样品进行常规 PCR检测以及基因测序分析，通过蛋鸭病毒人工感染前后的试验结果，用PCR确定及分析病毒感染情况。4病毒传播途径探究试验4.1病毒增殖培养病毒增殖培养、ELD50测定同病毒复制试验相同，所用毒株和蛋鸭来源均相同。4.2实验分组及方法实验分为三组（A组、B组、C组）每组蛋鸭18只，具体实验方法如下：A组：与感染病鸭混群，采用直接接触感染方式；B组：与感染鸭在一个空间（处于下风口）但不直接接触，采用空气传播感染方式；C组：空白对照，隔离饲养，不采取任何措施。4.3实验效果评价在实验开始前饲养要求同病毒复制实验。实验开始过程中三组
