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1、江 红 三所五室,核酸研究的基本技术,1. 核酸的分离、纯化和鉴定: 基因组DNA、质粒、总RNA 2. PCR技术: 反应体系、常见的PCR技术、 PCR产物的克隆、表达、鉴定 3. 核酸分子的杂交: Southern-blot Northern-blot 4. 新基因的克隆和功能研究,Tm值(DNA的熔点或解链温度),概念：指加热变性使 DNA的双螺旋结构失 去一半时的温度。,一、核酸的分离、纯化和鉴定 基因组DNA的分离、纯化：PCR、 Southern- blot、构建基因组文库 实验材料：哺乳动物组织(50100mg) 哺乳动物细胞(5x106107),实验步骤：RT 匀浆：TE p
2、H8.0 组织( 液氮冻存、研磨) 消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase 37/55 抽提：酚、氯仿、异戊醇 沉淀：异丙醇 / NaAc+无水乙醇 洗涤：75乙醇 干燥：风干 溶解：TE / H2O,注意事项： 1. 试剂：pH值准确 2. 蛋白酶K：20mg/ml， 分装，-20，避免反复冻融 3. 抽提：完全，不要触及蛋白层 4. 干燥：避免过分 5. 操作：小心，机械剪切作用，80100kb,2. 总RNA的分离纯化: RT-PCR、Northern-blot 实验材料：哺乳动物组织(50100mg) 哺乳动物细胞(5x106107),实验步骤： 匀浆：Trizol 组织( 液
3、氮冻存、研磨) 抽提：氯仿 沉淀：异丙醇 / NaAc + 无水乙醇 RT 15min 洗涤：75乙醇 干燥：风干 溶解：DEPC-H2O 保存：分装，-70，避免反复冻融,注意事项： (1) 无RNase环境：手套勤换、试剂专用、DEPC处理 玻璃器皿：180C干烤8小时以上 塑料器皿：氯仿冲洗 0.1%DEPC水溶液浸泡(RT 12h或37C 2h)，高压 灭菌去除DEPC,(1) 核酸的定量：,OD260：DNA, RNA; OD280：蛋白质 浓度： 1OD260： 50g/ml ds DNA 40g/ml ss DNA，总RNA 35g/ml 单链RNA 20g/ml 单链寡核苷酸
4、核酸纯度: OD260 / OD280 DNA 1.8 RNA 1.72.1 2.0 OD260和OD280应大于0.05，,(2) 核酸的凝胶电泳：分离、纯化 琼脂糖凝胶电泳：agarose, 水平, TAE, EB(2ng), 紫外灯,迁移率：同样大小的分子 超螺旋 线性分子 缺口或松弛,DNA Marker: DL2000, DNA/Hind,聚丙烯酰胺凝胶电泳: PAGE(Acr+Bis)， 垂直，银盐染色 非变性，变性,4. 质粒： 概念：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行 复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状 的共价闭环双链DNA分子。,载体：指可容忍外源DNA片段插入、可在
5、细胞间转移 并能在细胞内自主复制的DNA分子。 如:细菌质粒、噬菌体和某些病毒,组成：复制子、启动子、多克隆位点、选择标记基因,复制子：ColE1, pMB1, pSC101，控制着质粒在细菌中的拷贝数。 启动子：位于表达载体，启动基因的转录，如Ptac, PCMV, PSV40等。 多克隆位点(MCS)：人工合成的含多个单一限制性内切酶识别位点 的一段特殊的DNA序列，便于酶切、插入重组 和克隆DNA分子。 选择标记基因：Ampr、Tetr、Kanr、Neor,分类,按用途分类 克隆载体 表达载体：含有强启动子，使克隆化的外源基因转录产生大量 的mRNA。依其发挥作用的宿主细胞不同，分为 原
6、核、真核、酵母、昆虫、病毒表达载体。,按复制能力分类 严谨性质粒：它们的复制伴随着染色体复制，1几个拷贝。 松弛型质粒：它们的复制与染色体复制无关，10200拷贝，常用。,穿梭质粒：人工构建 两种不同复制起点和选择标记 两种不同的宿主细胞中存活和复制 转移基因 基因表达活性和功能,分离：碱裂解法、煮沸法：剧烈，小质粒 去污剂(SDS)裂解法：易受损的大质粒 (15kb),碱裂解法,收菌 重悬：TE-葡萄糖 裂解：变性，NaOH-SDS 5min 中和：复性，KAc 抽提：酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 沉淀：异丙醇 洗涤：70乙醇 溶解：TE-RNase A,纯化：氯化铯-溴化乙锭梯度平衡
7、离心 聚乙二醇分级沉淀法,Kit: 碱裂解，DNA介质(硅胶、玻璃奶),互补现象,pUC系列质粒 (lac操纵子),-半乳糖苷酶氨基端,细菌 (-半乳糖苷酶N-末端缺陷型),蓝色菌落,外源DNA插入,白色菌落,-半乳糖苷酶,缺陷型,蓝白筛选,1.原理 2.反应体系 3.类型 4.PCR产物的克隆、表达和鉴定,二、PCR(聚合酶链式反应)技术,1985, Mullis K, PCR，Klenow 1988, Saiki, Taq 酶,1、原理: 模板变性、引物退火、DNA pol进行DNA合成,PCR产物呈指数方式增加 2530个循环 理论109 实际105107,2、PCR反应体系：25100
8、 l,1)模板DNA：单链或双链DNA, 避免DNA聚合酶抑制剂和能 结合DNA的蛋白质污染, 10.1g。,2)引物：人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸。 20pmol,3)Mg2+的浓度：反应产物的特异性和产量，1.5mmol/L。,4)dNTP：50200mol/L，四种dNTP浓度相同。,5)Taq DNA聚合酶：Klenow, Taq酶, 高保真Taq酶, 2.5U/100l 。,6)参数：94 5min - 30(94 30sec - 55 30sec - 721 min) - 72 7min,1)长度一般为1825个碱基； 2)尽可能选择碱基随机分布的序列； 3
9、)两条引物的G+C的百分比应尽量相似，多为4555%； 4)避免引物内部形成二级结构； 5)两引物之间不应发生互补，特别是在3端; 6)引物3末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率，最好 选T、G或C，而非A； 7)引物5端允许有一段序列不与模板配对, 内切酶，保护碱基。,引物设计原则,退火温度计算公式： 1) T=2(A+T)+4(G+C)-35 2) T=22+1.46 ln35 ln=2(G or C)+(A or T) 2035nt 3) T=81.5+16.6lgJ+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%) J+=monovalent cations l=oligonuc
10、leotide length FA=formamide 1470nt,Taq酶合成延伸速率：22 0.25nt/sec， 37 1.5nt/sec， 55 24nt/sec， 70 60nt/sec 1.Taq酶单克隆抗体: 低温与Taq酶结合，抑制活性; 高温与Taq酶解离，释放活性。 2.模板变性后加入Taq酶。,热启动PCR: 提高特异性,3、影响因素,模板：ng级的质粒DNA，g级基因组DNA。 引物：引物浓度不宜偏高，否则易形成引物二聚体。 Mg2+浓度：特异性及产量 dNTPs浓度：正确性和产量 Taq酶用量：非特异性 循环参数：常规为2530个循环,对照：阳性对照 阴性对照：不加
11、模板,4、特点：特异性、有效性、忠实性,操作简便省时； 灵敏度高； 特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可以提高特异性； 对原始材料的质量要求较低； 有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为Taq DNA聚和酶缺乏35核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入。,1)反转录PCR：RT-PCR,5、常见类型,PCR,关键：总RNA完整性 反转录引物,随机引物,特异下游引物,第一轮PCR,第二轮PCR,2)巢式PCR: 模板数低,3) RACE: cDNA末端的快速克隆,AAAAA,m7Gppp,5,3,5RACE,3RACE,3RACE,5RACE,方法一：Cap-Finder,方法
12、二 GeneRacer,连接头,cDNA第一链,5末端,3末端,1.第一链的合成至关重要 1) 确定所需的mRNA的存在 2) mRNA中存在的稳定二级结构可能对反转录有影响， 采用热稳定的具反转录活性的DNA聚合酶 2.反转录结束后通过两次NH4Ac沉淀去除多余dNTP和引物 3.内源性同聚序列的影响 1)降低引物的用量 0.5pmol/g mRNA/20l反应体积 2)避免太低的杂交温度,注意,4)长片段PCR,Taq酶：LA Taq酶 5U/ 50l反应 dNTP: 2.5mM 8 l 延伸：5min 循环：25,6)差异PCR,5)DNA指纹分析：随机引物,遗传学图谱绘制、系统生物学、
13、发育生物学,1)大量扩增目的核酸片段 2)克隆新基因 3)生物多态性的研究 4)核酸测序 5)在核酸中引入突变 6)检测基因的整合、表达情况 7)疾病的诊断,6、PCR在生物学中的应用,1.需突变位点位于基因两侧，只需在合成引物时，直接加上突变碱基即可； 2、当突变位于基因的中间部位时，可以采用以下两种方法进行突变,在基因中引入突变,方法一,方法二,DNA的序列测定：Sanger双脱氧链终止法测序的原理,单链模板DNA,测序引物,5,3,4种dNTP(包括 32PdNTP) DNA聚合酶,ddTTP,ddCTP,ddGTP,ddATP,造成链末端终止的双脱氧核苷酸,新合成的DNA,1)阴阳性对
14、照 2)配制PCR混合物 PCR buffer+dNTP+H2O 3)控制污染: 靶序列污染，气溶胶 紫外线照射 更换实验场所、设备、试剂 暂停实验,7、注意事项,8、限制性核酸内切酶,核酸酶：是一类能切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二 酯键，使核酸分子多核苷酸链发生水解的蛋白酶。 基因工程中最常用的核酸酶是核酸内切酶。 限制性核酸内切酶: 简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子 中特异核苷酸序列的DNA水解酶，它能特 异地结合于限制酶识别序列或其附近的位 点，并在此切割双链DNA分子。,概念,分类,I类: 识别部位复杂，特异性差，在识别序列周围400 7000bp范围内切割DNA。 II类：能识别双链DNA的特定序列并进行切割，产生特异 的DNA片段，常规应用于分子克隆中。 III类：在识别位点周围2727bp范围内切割DNA。,命名原则,EcoR I,第一个大写字母：属的缩写 两个小写字母：种的缩写 第二个大写字母：不同变种和品系的缩写 罗马数字： 同一微生物中多种限制酶分离的顺序,特征,识别序列：46个核苷酸，迴文结构。 切割产物：同时切割dsDNA的两条链 平滑末端或粘性末端,酶活性单位,一个活性单位：在适当的反应条件，1小时， 完全酶解1g DNA底物， 限制性内切酶的量。,单酶切/双酶切反应：30 l,37 4h,标准的酶解反应：50l反应体系，1U内切酶，
