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1、代谢组学：基于质谱的研究方法,汇报人：张富昌 指导教师：田中民 2014年4月13日,内容提要,一、代谢组学基本知识 二、 GC-MS和LC-MS 三、发现代谢组学,一、代谢组学基本知识,1、什么是代谢组学,代谢组学是通过比较对照组和实验组的代谢组（metabolomes，某一生物的所有代谢物组分），以寻找其它代谢谱差异的研究方法。这些差异可能与临床生物标志物发现中研究的某些疾病相关，也可能与药物研发毒理研究中候选药物摄入后的代谢改变有关。,一、代谢组学基本知识,2、代谢组学的一般流程,发现代谢组学,靶向代谢组学,代谢组学,一、代谢组学基本知识,3、发现代谢组学的一般流程,鉴定，进行代谢谱分析
2、后，测定这些代谢物的化学结构,代谢谱分析（也称为差异表达分析），在一组实验和对照样品中，寻找丰度改变有统计学意义的感兴趣代谢物,解释，研究流程的最后一步，解释所发现的代谢物与生物过程或生物状态之间的关联,一、代谢组学基本知识,4、靶向代谢组学的一般流程,靶向代谢组学分析的重点是采用大量天然和生物变异样本，验证预先确认的代谢物。需要用分析标准品进行定量分析。,一、代谢组学基本知识,5、代谢组学的一般流程,二、GC-MS和LC-MS,1、质谱在代谢组学中的应用,质谱(MS)因具有广泛的动态范围、能进行可重现的定量分析，而且能够分析非常复杂的生理体液，已被用于代谢组学的研究中。由于这类样品的复杂性，
3、为了尽可能多地检测代谢物，在质谱分析之前常常还要进行分离（气相色谱、液相色谱或毛细管电泳）,2、代谢组学中所用的分离技术,气相色谱(GC) GC 要求挥发性，要用化学衍生化的样品 液相色谱(LC) 不能完全解决代谢组中亲水组分的分离问题 毛细管电泳(CE) 所用的缓冲液却不能与质谱仪的离子源兼容 亲水相互作用色谱(HILIC),二、GC-MS和LC-MS,3、代谢组学的挑战,1、典型的代谢组学实验需大量样品才能得到精确统计的结果 2、代谢组学研究通常需要多种技术；某种类型的样品往往比其他样品更适合采用某种特定的分析技术 3、需要高度灵敏和精确的仪器 4、强大的软件工具对处理实验所产生的大量数据
4、非常重要 处理GC/MS 和LC/MS 数据的色谱解卷积程序、寻找有意义代谢物的一系列统计分析工具、帮助鉴定代谢物的代谢物数据库，以及最终绘制分子间相互作用网络图的生物信息学软件等。,二、GC-MS和LC-MS,4、GC/MS 分析,气相色谱和质谱(GC/MS)是分析挥发性化学物质的有效组合。气相色谱使用运载气推动分析物通过涂渍的熔融石英毛细管。基于分析物在气相和毛细管内涂层之间的不同分配实现分离。,二、GC-MS和LC-MS,4、GC/MS 分析,电子轰击电离(EI)是GC/MS 最常用的电离技术，非常耐用而且重现性好，而且不会受离子抑制的影响 简单的鉴定方法只需要扣除了背景的EI 图谱，和
5、一个通用EI谱库检索，如NIST 谱库。更有效的鉴定方法是采用包含了预期的化合物保留时间和EI 图谱的特定应用数据库同时对分析物的色谱保留时间和质谱图进行检索,二、GC-MS和LC-MS,4、GC/MS 分析,EI源的缺点 EI 电离经常会导致分子离子的丢失-找不到匹配 的EI谱-缺少的分子离子的质量信息将使可能的化合物的数量变得非常庞大 因此，GC/MS最适合对已知的或预期的代谢物进行分析,二、GC-MS和LC-MS,5、LC/MS 分析,液相色谱可以分离无挥发性和未衍生化的代谢物。因此，LC/MS可以分析的化合物种类范围比GC/MS 更广 电喷雾(ESI) 和大气压化学电离(APCI)是L
6、C/MS 最常用的两 种电离技术-ESI 和APCI 都可能出现离子抑制，因此共洗脱化合物可能被低估甚至检测不到,二、GC-MS和LC-MS,5、LC/MS 分析,目前没有可用于LC/MS 鉴定的谱库。但由于LC/MS 分析中 通常都有分子离子，其质量可以用代谢物数据库进行检索，如 METLIN 数据库 Q-TOF可以通过分子离子计算出经验式 LC/MS 最适合作为未知代谢物研究中的探索方法，或者在多种目标代谢物由于挥发性问题不能用GC/MS 进行分析时采用,二、GC-MS和LC-MS,6、LC/MS 、GC/MS分析化合物的范围,二、GC-MS和LC-MS,三、发现代谢组学,1、发现代谢组学
7、的概念,发现代谢组学主要是将对照组和实验组的代谢组（某一生物体的全部代谢物）进行比对，以找出其代谢谱的差异。 发现代谢组学分析一般包括以下几个步骤： 代谢谱分析（也称为差异表达分析），在一组实验和对照样品中，寻找丰度改变有统计学意义的感兴趣代谢物 鉴定，进行代谢谱分析后，测定这些代谢物的化学结构 解释，研究流程的最后一步，解释所发现的代谢物与生物过程或生物状态之间的关联,三、发现代谢组学,2、代谢谱分析，寻找有统计学意义的代谢物,分析重现性对表达谱分析至关重要-分析变异越小，所需的重复数就越少 代谢谱分析是经过复杂的特征提取，对已知代谢物进行靶向代谢谱分析，以寻找意外的代谢物-代谢物以其分子特
8、征为标志表示，包括保留时间、质量或质谱图及丰度 在代谢谱分析过程中，并不一定要知道该化合物/ 代谢物是什么。但为了在不同次的样品分析之间跟踪这些化合物，必需要用到其物理性质,三、发现代谢组学,3、发现代谢组学有以下六个步骤,1、 分析，包括代谢物的分离和检测，一般采用GC/MS 或LC/MS 2、 寻找特征，包括寻找样品中的所有代谢物。一个代谢物检测不到，就意味着丧失了一次机会；因此尽可能多地检测出样品中的代谢物至关重要,三、发现代谢组学,3、发现代谢组学有以下六个步骤,三、发现代谢组学,3、数据标准化，对保留时间和响应的漂移给予必要的校正 4、统计分析，用于发现样品组别之间的统计学差异 5、
9、鉴定，GC/MS 所得的EI 图谱非常适合进行谱库检索 6、解释，一旦代谢物被鉴定出来，就需要通过解释实验结果，推断其在代谢的生物通路中的地位,3、发现代谢组学有以下六个步骤,三、发现代谢组学,4、安捷伦GC/MS 在发现代谢组学中的应用,在 分析 方面： 良好的重现性，以便对大量样品进行比对和校正 卓越的可靠性，最大限度地延长正常运行时间，分析大量样品 高灵敏度，能够检测复杂样品中的低水平代谢物，动态范围 超过6 个数量,三、发现代谢组学,4、安捷伦GC/MS 在发现代谢组学中的应用,在 寻找特征 方面： 安捷伦提供自动化质谱解卷积和鉴定软件(AMDIS) 进行解卷 积，该软件是NIST 谱
10、库检索软件包的一部分。AMDIS 软件 包设计用于： 发现相关的协变离子，用单组分色谱峰表示 从复杂的GC/MS 数据中提取出单纯组分质谱图 重建用于EI 谱库检索的质谱图,三、发现代谢组学,4、安捷伦GC/MS 在发现代谢组学中的应用,在 数据标准化和统计学分析 方面： 统计学分析软件需要具备以下功能： 从大样本组和复杂的实验设计中，对数据（包括元数据）进 行轻松输入、标准化和对比 发现复杂的实验设计中数据间的联系不局限于两两对比 鉴定后能够通过通路分析进行生物学解释 安捷伦的Mass Profiler 专业软件让您能够轻松输入、标准化、 比较并图形化显示大样本组的GC/MS 和LC/MS
11、数据，从而 快速发现代谢物标志物，并支持元数据分析。我们用的是SIMCA-P,三、发现代谢组学,4、安捷伦GC/MS 在发现代谢组学中的应用,在 数据标准化和统计学分析 方面：,三、发现代谢组学,4、安捷伦GC/MS 在发现代谢组学中的应用,在 解释 方面： 安捷伦Mass Prof iler 专业软件的通路分析功能，可以利用已知的或独特的、用户基于已有数据设定的通路进行解释，大大简化了这一过程,三、发现代谢组学,5、LC/MS 在发现代谢组学中的应用,在 分析 方面： 以下几点对代谢谱分析非常重要： 良好的LC 和MS 重现性，以便对大量样品进行比对和校正 卓越的可靠性，最大限度地延长正常运
12、行时间，分析大量样 品 高灵敏度，能够检测复杂样品中的低水平代谢物，动态范围 超过5 个数量级,三、发现代谢组学,5、LC/MS 在发现代谢组学中的应用,在 寻找特征 方面： 安捷伦的MassHunt er LC/MS 工作站软件包含获得专利的分子特征提取算法，专为精确质量LC/MS 飞行时间数据而设计， 能够识别与单一化合物相关的协变离子。此外，它还能识别和 解析常见的电喷雾干扰离子，如钠加合离子或二聚体的形成。 对这些离子鉴别和分组可以改善统计分析所用的定量估算，并从随后的分析中除去伪数据,三、发现代谢组学,5、LC/MS 在发现代谢组学中的应用,在 鉴定 方面： METLIN数据库： 安捷伦METLIN 个人代谢物数据库软件是目前最全面的代谢物数据库 可以根据关键词、分子式、化合物名称，或K E G G 、C A S 、 HMP 或METLIN 编号进行信息查询 该数据库软件能够与MassHunt er Prof iler 专业软件无缝整合，共同进行统计学处理和通路分析,三、发现代谢组学,5、LC/MS 在发现代谢组学中的应用,在 解释 方面： 安捷伦Mass Prof iler 专业软件的通路分析功能，可以利用已知的或独特的、用户基于已有数据设定的通路进行解释，大大简化了生物通路过程,
