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1、紫杉醇作为一种高效、广谱的抗癌药物，它在内生真菌中的含量直接决定了该菌株的药用价值。HPLC法通常作为检测紫杉醇的基本方法，常用于定量分析紫杉醇含量。可根据保留时间判断是否含有紫杉醇和紫杉烷类代谢产物4。10-去乙酰紫杉醇（10-deacetylpaclitaxel，10-DAP）是理想的紫杉醇半合成前体，而7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇（7-Xylosyl-10-deacetylpaclitaxel，10-DAXP）可以转化为10-去乙酰紫杉醇。多烯紫杉醇（Docetaxel）是紫杉醇的衍生物，通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必须的微管网络而具有抗肿瘤作用。本章研究我们利用高效液相色
2、谱技术（HPLC）对过表达枝霉MD2菌株A10182-MD2、A10251-MD2所含有的紫杉醇、及紫杉醇前体巴卡亭、10-去乙酰巴卡亭、7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、多烯紫杉醇的含量进行检测，考察这些成分在过表达MD2菌株中的含量情况及对照野生型MD2菌株的变化，为后期的实验提供基础。PDL、PDA培养基的配方同第三章。表4.1仪器概览Table4.1Instrumentoverview仪器名称生产厂家安捷伦1200Series高效液相色谱仪安捷伦科技有限公司KQ-500E型超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司Southern电泳仪美国BIO-RAD公司METTLERTO
3、LEDO分析天平瑞士奥然科技有限公司SHZ-循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂RE-52型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂干燥箱分子杂交仪水浴锅成像系统QuantStudio5荧光定量PCRNanodrop2000上海精宏实验设备有限公司上海乔枫实业有限公司上海一恒科学仪器有限公司美国Synoptics公司赛默飞世尔科技有限公司赛默飞世尔科技有限公司（1）购置所有标准品均购自上海源叶生物科技有限公司；茉莉酸甲酯购自上海金穗生物科技有限公司；色谱甲醇购自成都市科隆化学品有限公司；色谱乙腈购自赛默飞世尔科技有限公司；甲醇、氯仿购自国药基团化学试剂有限公司；尼龙膜购自BIOSHARP、DIGHighPrim
4、eDNALabelingandDetectionStarterKit（forcolordetectionwithNBT/BCIP）购自Roche。（2）试剂的配置1.5moL/LNaCl：称取17.55g的NaCl，用超纯水定容至200mL。0.5moL/LNaOH：称取4g的NaOH，用超纯水定容至200mL。0.2MHCl：用量筒量取16.8mL的浓盐酸，用100mL超纯水稀释，待溶液冷却后，用超纯水定容至1L。20SSC：称取175.3gNaCl，88.2g柠檬酸钠.2H2O，800mL的水溶解，用浓HCL调PH至7.0，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。马来酸缓冲液：称取11.6
5、g马来酸，8.76gNaCl，先用900mL的超纯水溶解，在20用NaOH调pH至7.5后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。洗膜缓冲液：称取11.6g马来酸，8.76gNaCl，先用900mL的超纯水溶解，再加入3mLTween20，在20用NaOH调pH至7.5后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。检测缓冲液：称取5.85gNaCl，用900mL的超纯水溶解后，加入100mL1MTris-HCl（称取12.44gTris碱，加超纯水充分搅拌溶解，调至pH至7.4，定容至100mL），在20调pH至9.5后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。TE缓冲液：称取0.29gEDT
6、A，用900mL的超纯水溶解后，加入10mL1MTris-HCl，调pH至8.0后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。10%SDS：称取10gSDS，加入80mL超纯水溶解（68促溶），调至pH7.2，定容至100mL，高温高压灭菌20min备用。4.3.1Southern-blot分析转基因菌株中目的基因的整合情况（一）探针的标记1.以MD2基因组DNA为模板，扩增UnigeneA10182、A10251，经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，测量回收产物浓度。2.取1g回收产物,用ddH2O补足至16L。100沸水浴10min使DNA变性后迅速插入冰水混合物中。3.根据DIGHighPrim
7、eDNALabelingandDetectionStarterKit（forcolordetectionwithNBT/BCIP）的操作方法进行后续实验。4.加4LDIG高效引物到已变性的DNA中，短暂离心后加入2L预染Marker,37标记4h.。5.65作用10min终止标记反应。-20保存备用。（二）基因组DNA的提取提取MD2、MD2转化子的基因组DNA，方法同2.4.1“改良SDS-CTAB”法。提取完成后加入RNaseA37作用1h后加入苯酚/氯仿（1:1，V/V）抽提一次，以去除RNA的干扰。（三）基因组DNA的限制酶切用构建表达载体时所设计的目的基因两端的酶和表达框两端的酶对枝
8、霉MD2（阴性对照）、过表达载体质粒（阳性对照）、MD2转化子基因组DNA进行酶切。酶切体系如下：表4.2酶切体系Table4.2Thesystemofrestrictionenzymereaction组分体积基因组DNA/表达框质粒FDbuffer酶酶ddH2O20g3L5L5Lto30L12000rpm离心，保证反应体系的精确，37酶切16h;65水浴10min，终止酶切反应。（四）DNA片段电泳分离采用0.8%的琼脂糖凝胶，先用200V电压电泳10min，再调节电压至30V电泳16h。电泳结束后，小心取出胶，切左上方小角做标记。（五）转膜1.脱嘌呤处理：当目的片段大于15Kb时，需要进行
9、脱嘌呤处理。将胶置于0.2mol/L盐酸中处理10-15min。当溴酚蓝由蓝色变为橘黄色时，证明胶已处理完成。用双蒸水漂洗两次，每次20min。2.碱变性：将胶浸泡于1.5mol/LNaCl、0.5mol/LNaOH变性液中30min。3.中和：用双蒸水漂洗凝胶后置于1mol/LTris-HCl、1.5mol/LNaCl中和液中浸泡两次，每次15min。4.搭建转移平台：在一个大池盘中放置一块比凝胶大的平台，倒入转移液，但转移液液面要低于平台，在平台上铺三张已在转移液中浸泡过的滤纸，用干净的玻璃棒轻轻推走滤纸间的气泡，滤纸两端垂入转移液中，按凝胶大小剪裁一张尼龙膜，剪去左上方小角以做标记，并置
10、于转移液中浸泡5min。5.将胶从中和液中小心取出，使其背面向上，置于转移平台中的滤纸上，小心赶走滤纸与胶间的气泡；用封口膜围绕胶的四周外缘的无DNA区，防止转膜出现短路的情况。6.将尼龙膜置于胶上，使其缺角与胶的缺角对应。剪取三张与胶大小一样的滤纸置于膜上，小心赶走它们之间的气泡。7.在滤纸上防置一叠吸水纸，然后在吸水纸上压约500g重物。转移16-18h，每隔3h换置一次吸水纸。在池盘中倒入足够的转移液以保证转移的顺利进行。8.转移结束后，弃去吸水纸、滤纸，翻转膜，在膜上小心标记以区分点样位置和正反面。9.将凝胶用溴化乙锭染色，于紫外灯下观察，确定是否转移完全，转移完全再进行以下步骤。10
11、.将膜置于保鲜膜上，晾干，于紫外灯下交联（254nm，1200J/cm2，30-45s），使DNA固定在膜上。（六）预杂交将膜放入杂交瓶中，加入预杂交液（每平方厘米尼龙膜约0.2mL预杂交液），置于已45预热的杂交箱中预杂交2h。（七）杂交弃去预杂交液，按相同的体积加入杂交液，并于杂交液中加入探针（探针使用浓度为25ng/mL杂交液），置于45杂交箱中杂交16h。（八）洗膜取出杂交膜，使用以下溶液，依次进行洗膜：1.2SSC，0.1%SDS，浸膜。2.2SSC，0.1%SDS，室温洗膜两次，每次15min。3.0.5SSC，0.1%SDS，68洗膜两次，每次15min。4.0.1SSC，0.1
12、%SDS，室温洗膜两次，每次15min。洗膜完毕后用滤纸将膜上的水分吸干。（九）显色1.将膜置于Washingbuffer中，室温温育5min。2.在封闭液中室温缓慢震荡15min。3.弃去封闭液，用10ml含有1：10000的抗地高辛的碱性磷酸酶结合物的封闭液室温震荡15min。4.将膜置于Washingbuffer中，室温漂洗两次，每次15min。5.将膜置于Detectionbuffer中，室温漂洗膜2min。6.将膜取出，用吸水纸吸去多余水分，置于暗室中，DNA面朝上，吸取5ml底物显色液（含有100LNBT/BCIPstocksolution的检测缓冲液）小心滴加在膜表面，使膜完全被
13、覆盖，暗室显色30min，观察结果。4.3.2qRT-PCR分析过表达菌株中目的基因的表达量1.候选基因qRT-PCR引物的设计根据qRT-PCR引物设计要求设计候选基因A10182和A10251的引物，选取18SrDNA作为内参，引物设计如下：表2.2克隆候选基因的引物序列Table2.2Sequencesoftheprimersforcloningcandidategenes引物名称引物序列A10182QF5-CGCAGACCTTGTTCGACCGATC-3A10182QR5-CGTTGGATACCAAGCACGTACTCG-3A10251QF5-CGATCAAGCAGCAGCAGTAGA
14、GG-3A10251QR5-CCGATGGTCTGTGTTGATGGTGAG-32.转基因菌株的培养分别挑选三个A10182转基因菌株的转化子与A10251转基因菌株的转化子及对照枝状枝孢霉MD2接种于100mL含有30g/mLHygB和100g/mLCef抗性的PDL培养基中，28，150rpm培养5d后分别添加200mMeJA后继续培养0h、6h、12h、18h、24h、30h，收集菌体。2.转基因菌株总RNA的提取（1）取约0.1g菌体于预冷研钵中，迅速加入液氮研磨至粉末，转移至2mL预冷的EP管中；（2）加入750LTRIZOL提取液剧烈震荡摇匀，室温静置5min；（3）加入300L氯
15、仿，剧烈颠倒EP管15s，室温静置3min，12000g，4离心15min；（4）溶液呈现分层现象，吸取上层溶液至一新的EP管中，加入等体积氯仿，剧烈颠倒EP管5min，12000g，4离心15min；（5）取上清于一新的EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min，12000g，4离心15min，沉淀RNA；（6）75%乙醇洗涤沉淀，7500g，4离心5min，弃乙醇，瞬时离心以去除管壁上的残留乙醇；（7）在酒精灯旁晾干沉淀，加入50L无核酶水溶解沉淀；（8）取3LRNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳检测200V，5min，并利用Nanodrop2000检测RNA的质量，并其余样品保存于-80。3.第一链cDNA的合成采用ThermoRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit进行RNA的反转录，步骤如下：（1）RNA的变性RNA的变性反应体系如下：表3.2RNA变性反应体系Table3.2ReactionsystemforRNAdegeneration成分用量(L)RNasefre
