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1、2014/3/1 1 液质联用分析方法开发及条件液质联用分析方法开发及条件 优化优化 一、概述一、概述 LC-MS的实验目的 电离方式的选择 ESI 或APCI 正离子或负离子 色谱柱因素 直径和流速 管路连接（Plumbing） 流动相因素 pH 溶剂 其他 液质联用应用实例 二、样品的预处理二、样品的预处理 认为认为LC/MS/MSLC/MS/MS不需要样品预处理的理解是片面的不需要样品预处理的理解是片面的 LC/MS/MSLC/MS/MS 分析方法的现实情况分析方法的现实情况 由于由于MS/MSMS/MS有很好的选择性有很好的选择性, , 用户很少能够“看到”基质用户很少能够“看到”基质
2、 MS/MSMS/MS模式下，成百上千的基质谱峰是“看不见”的模式下，成百上千的基质谱峰是“看不见”的 MS/MS MS/MS 用户希望有最低的检测限用户希望有最低的检测限, , 因此他们可能会进更多因此他们可能会进更多 的样品到的样品到LC/MS/MS LC/MS/MS 系统当中系统当中 “看不见”看不见” 的基质谱峰会变得更加严重的基质谱峰会变得更加严重 许多后流出化合物并不是完全适合色谱分析，因此色谱柱许多后流出化合物并不是完全适合色谱分析，因此色谱柱 当中会有残留物产生当中会有残留物产生 这些残留物会随着不断的进样而渐渐增多这些残留物会随着不断的进样而渐渐增多 样品分析的越多，基质之间
3、的互相干扰也越严重样品分析的越多，基质之间的互相干扰也越严重 大量的基质会使离子源污染得更快并且损失灵敏度大量的基质会使离子源污染得更快并且损失灵敏度 ( (一一) )、样品的预处理目的、样品的预处理目的 为什么需要液相分离 串联质谱具有高选择性，为什么需要液相分离 离子化过程中的基质效应 基质物质与分析物共同流出喷雾针时，可 影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应 及带电过程，导致进入质谱的离子减少（离子 抑制）或增多（离子增强），从而影响定量结 果的可靠性和准确性，以及方法的重现性及线 性 改善线性和准确性提高灵敏度 更好的专属性 基质干扰：Loop进样 基质干扰 : 用色谱柱将基质和分
4、析物分离 2014/3/1 2 二、样品的预处理二、样品的预处理 从保护仪器角度出发从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样防止固体小颗粒堵塞进样 管道和喷嘴管道和喷嘴，防止污染仪器防止污染仪器，降低分析背景降低分析背景，排排 除对分析结果的干扰除对分析结果的干扰 从从ESIESI电离的过程分析电离的过程分析 ESIESI电荷是在液滴的表面电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面样品与杂质在液滴表面 存在竞争存在竞争，不挥发物不挥发物（如磷酸盐等如磷酸盐等）防碍带电液防碍带电液 滴表面挥发滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气大量杂质防碍带电样品离子进入气 相状态相状态，增加电荷中和的可
5、能增加电荷中和的可能 ( (一一) )样品的预处理目的样品的预处理目的 （二二）样品基质影响）样品基质影响 质谱检测器可耐受挥发性缓冲盐的使用质谱检测器可耐受挥发性缓冲盐的使用 然而然而 缓冲盐的类型和浓度干扰离子化过程缓冲盐的类型和浓度干扰离子化过程 （二二）样品基质影响样品基质影响 （三）样品的预处理常用方法（三）样品的预处理常用方法 超滤超滤 溶剂萃取去盐溶剂萃取去盐 固相萃取固相萃取 灌注灌注（PerfusionPerfusion）净化去盐净化去盐 色谱分离色谱分离 反相色谱分离反相色谱分离 亲和技术分离亲和技术分离 甲醇或乙腈沉淀蛋白甲醇或乙腈沉淀蛋白 酸水解酸水解，酶解酶解 衍生化
6、衍生化 三、三、LCLC- -MSMS分析条件的选择分析条件的选择 （一）（一）、接口的选择、接口的选择 ESIESI和和APCIAPCI在实际应用中表现出它们各自的在实际应用中表现出它们各自的 优势和弱点优势和弱点 这使得这使得ESIESI和和APCIAPCI成为了两个相互补充的分成为了两个相互补充的分 析手段析手段 概括地说，概括地说，ESIESI适合于中等极性到强极性的适合于中等极性到强极性的 化合物分子，特别是那些在溶液中能预先化合物分子，特别是那些在溶液中能预先 形成离子的化合物和可以获得多个质子的形成离子的化合物和可以获得多个质子的 大分子（蛋白质）大分子（蛋白质） 只要有相对强的
7、极性，只要有相对强的极性，ESIESI对小分子的分析对小分子的分析 常常可以得到满意的结果常常可以得到满意的结果 1、液质联用技术的相对适用范围液质联用技术的相对适用范围 2014/3/1 3 2 2、接口的选择接口的选择 APCIAPCI不适合可带有多个电荷的大分子，它的优势不适合可带有多个电荷的大分子，它的优势 在于非极性或中等极性的小分子的分析在于非极性或中等极性的小分子的分析 ESI对高分子量生物大分子和聚合物电离会生成多 电荷离子，而APCI在任何化合物电离中不能产生 多电荷离子，并以（准）分子离子为主 ESI多适合反相液相色谱 APCI要比ESI更适合正相液相色谱 （1 1）ESI
8、ESI和和APCIAPCI的比较的比较 比较项目比较项目 ESIESI APCIAPCI 可分析样可分析样 品品 蛋白质、肽类、低聚核苷酸；蛋白质、肽类、低聚核苷酸； 儿茶酚胺、季铵盐等；含杂儿茶酚胺、季铵盐等；含杂 原子化合物如氨基甲酸酯等，原子化合物如氨基甲酸酯等， 可用热喷雾分析的化合物可用热喷雾分析的化合物 非极性中等极性的小分子，如脂非极性中等极性的小分子，如脂 肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化 合物如氨基甲酸酯、脲等，可用热合物如氨基甲酸酯、脲等，可用热 喷雾、粒子束技术分析的化合物喷雾、粒子束技术分析的化合物 不能分析不能分析 样品样品 极端非极性样品
9、极端非极性样品 非挥发性样品，热稳定性差的样品非挥发性样品，热稳定性差的样品 基质和流基质和流 动相的影动相的影 响响 对样品的基质和流动相组成对样品的基质和流动相组成 比比APCIAPCI更敏感；对挥发性很更敏感；对挥发性很 强的缓冲液也要求使用较低强的缓冲液也要求使用较低 的浓度；出现的浓度；出现NaNa+ +，K K+ +ClCl- -， CFCF3 3COOCOO- -等离子的加成等离子的加成 对样品的基质和流动相组成的敏感对样品的基质和流动相组成的敏感 程度比程度比ESlESl小；可以使用稍高浓度的小；可以使用稍高浓度的 挥发性强的缓冲液；有机溶剂的种挥发性强的缓冲液；有机溶剂的种
10、类和溶剂分子的加成影响离子化效类和溶剂分子的加成影响离子化效 率和产物率和产物 2 2、接口的选择接口的选择 （1 1） ESI和APCI的比较 比较项目比较项目 ESIESI APCIAPCI 溶剂溶剂 溶剂溶剂pHpH对在溶剂中形成离对在溶剂中形成离 子的分析物有重大的影响，子的分析物有重大的影响， 溶剂溶剂pHpH的调整会加强在溶的调整会加强在溶 液中非离于化分析物的离子液中非离于化分析物的离子 化效率化效率 溶剂选择非常重要并溶剂选择非常重要并 影响离子化过程；溶影响离子化过程；溶 剂剂pHpH对离子化效率对离子化效率 有一定的影响有一定的影响 流动相流速流动相流速 在低流速在低流速(
11、750 l) l)比比 APCIAPCI差差 在低流速（在低流速（750 l l）好于）好于 ESIESI 碎片的产生碎片的产生 CIDCID对大部分的极性和中等对大部分的极性和中等 极性化合物可产生显著的碎极性化合物可产生显著的碎 片片 比比ESIESI更为有效并常有更为有效并常有 脱水峰出现脱水峰出现 （2）ESI vs. APCI 电离方 式 流速 (mL/mi n) 样品类型 MW 范围 ESI 0.001- 1.0 多电荷离子 MW 1000 Da O2 2) )可接受可接受H H+ +、NaNa+ +、NHNH4 4+ +，如，如NHNH2 2、N N、 NHNH、COCO、COO
12、RCOOR 样品中含有仲氨或叔氨基时可优先考虑使用正离子模式样品中含有仲氨或叔氨基时可优先考虑使用正离子模式 2014/3/1 4 （4 4）正、负离子模式的选择）正、负离子模式的选择 (2)(2)负离子模式适合于酸性样品负离子模式适合于酸性样品 可用可用氢氧化铵、四乙基铵、四甲基铵以提高其氢氧化铵、四乙基铵、四甲基铵以提高其pHpH值值, ,对对 样品进行碱化。样品进行碱化。pHpH要至少高于要至少高于pKapKa值两个单位值两个单位 某些蛋白、寡核苷酸、有些糖( saccharides) 和多聚糖 (polysaccharides)、某些药物的代谢物(例如葡糖苷酸共 轭物(glucuron
13、ideconjugates)含强负电性基团物质含强负电性基团物质 有无杂原子有无杂原子(O(O2 2 N N2 2) ) 可失去质子可失去质子? COOH? COOH、SHSH、NONO2 2 3.3.可正可负可正可负: : 比较灵敏度比较灵敏度 样品中含有仲氨或叔氨基时可优先考虑使用正离子模式样品中含有仲氨或叔氨基时可优先考虑使用正离子模式 如果样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和如果样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和 多个羟基时可尝试使用负离子模式多个羟基时可尝试使用负离子模式 （4 4）正、负离子模式的选择）正、负离子模式的选择 有些酸碱性并不明确的化合物则要进行预试方
14、有些酸碱性并不明确的化合物则要进行预试方 可决定，此时也可优先选用可决定，此时也可优先选用APCI(+)APCI(+)进行测定进行测定 具体分析物的具体分析物的pKapKa值未知化合物时，可选用值未知化合物时，可选用3 3个个 pHpH区域以正离子和负离子模式分别进行测试，区域以正离子和负离子模式分别进行测试， 然后选择一个然后选择一个APCIAPCI响应高的方法响应高的方法 另外也可通过调节电晕放电电压和喷雾温度，另外也可通过调节电晕放电电压和喷雾温度， 使喷雾和电离优化，但在调节喷雾温度时要注使喷雾和电离优化，但在调节喷雾温度时要注 意防止分析物的热解离意防止分析物的热解离 （5 5）分析
15、物的衍生化）分析物的衍生化 通过分析物的衍生化，使分析物更易离子化和通过分析物的衍生化，使分析物更易离子化和/ /或具或具 有高表面活性，对于中性有机分子如烯类、炔类、烷有高表面活性，对于中性有机分子如烯类、炔类、烷 基卤代类、醇类、酚类、硫代类和氨类可以引入易带基卤代类、醇类、酚类、硫代类和氨类可以引入易带 电类的功能基团，这些功能基团使分析物能通过加合电类的功能基团，这些功能基团使分析物能通过加合 和质子化进行电离；也可以通过引入电化学反应功能和质子化进行电离；也可以通过引入电化学反应功能 基团给这些中性分子使它们通过氧化还原进行电离基团给这些中性分子使它们通过氧化还原进行电离 另外也可以通过给分析物引入非极性基团来提高分析另外也可以通过给分析物引入非极性基团来提高分析 物在物在ESIESI液滴的表面活性，如
