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1、 多变量药物多变量药物 技术路线 技术路线 生物学特性检测 形态学观察、倍增时间、细胞活率检测 免疫组化、FACS 特异标志物、RT-PCR 检测 染色体核型分析、AP 检测 mES 标准体系培养 mES非分化增殖 mES niche 模拟培养 mES 分化为 EBs 流式细胞术、 RT-PCR 检测 EBs 形态学观察 LN, FN, E-cadherin 表达差异检测 RT-PCR 检测 免疫组化检测 FACS 检测 甲基化修饰检测 MSP 检测 Nanog 等 CpG 岛甲基化状态 免疫组化检测 H3R2 等的表达 ChIP 检测 H3 修饰的位置 甲基化抑制/启动剂作用 EBs 后的基
2、因表达分析 技术路线： 技术路线： 临床资料 淋巴瘤患者 病理活检 常规病理组织学诊断与分型 制成单个核 RT-PCR 诊断：t（14；18）, 细胞悬液 t（11；18）,t（11；14）,t（8； 14）,t（9；14）,t（2；5）等 染色体易位后形成的融合基因 相关探针直接间期 FISH： CCND1，BCL2，BCL6，PAX5， ALK，NPM，MYC，IgH 分析中药以PGC-1分析中药以PGC-1依赖的途径为核心的相关基因表达的影依赖的途径为核心的相关基因表达的影 分析中药对以上途径相关蛋白表达的影响 分析中药对以上途径相关蛋白表达的影响 揭示中药影响ROS和葡萄糖/能量代谢调
3、节平衡的作用物质、 靶点和调控网络 microarray 揭示中药影响ROS和葡萄糖/能量代谢调节平衡的作用物质、 靶点和调控网络 microarray 二维电泳二维电泳-质谱质谱 正常脑神经细胞 正常脑神经细胞 过氧化氢造成葡萄糖 消耗降低，能量生成减 少 过氧化氢造成葡萄糖 消耗降低，能量生成减 少 对象药物 对象药物 比较药物对ROS、抗氧化酶活力的影 质谱检测 比较药物对ROS、抗氧化酶活力的影 质谱检测 流式细胞检测仪流式细胞检测仪 有效中药的化学成分分析分离有效中药的化学成分分析分离 有效组分/成分的制备 有效组分/成分的制备 HPLC-MS 半制备液相色谱 HPLC-MS 半制备
4、液相色谱 比较药物对葡萄糖消耗的影响 比较药物对葡萄糖消耗的影响 代表性药物 文献研究 样品采集、提取物制备 毒性及其致毒机制 （肝微粒体、线粒体功能） 效应物质基础 （色谱、质谱、核磁、联用技术) 生理/病理状态下机体对毒性物质的 应答差异表达 （系统生物学） 有毒中药的安全使用窗口 （毒性与药效的相关分析 ） 代表性药物 文献研究 样品采集、提取物制备 毒性及其致毒机制 （肝微粒体、线粒体功能） 效应物质基础 （色谱、质谱、核磁、联用技术) 生理/病理状态下机体对毒性物质的 应答差异表达 （系统生物学） 有毒中药的安全使用窗口 （毒性与药效的相关分析 ） 培养基改良培养基改良 肉膏培养基肉
5、膏培养基生活废水培养基生活废水培养基绿豆水培养基绿豆水培养基 培养 条件 优化 培养 条件 优化 工艺 流程 优化 工艺 流程 优化 纯度检测、药效检测纯度检测、药效检测 a -溶血链球菌溶血链球菌33#菌株菌株 绿豆水培养基绿豆水培养基 葡萄糖及12种氨基酸 标准品 快速HPLC方法 确定最优MS条件 确定样品前处理方法 葡萄糖氨基酸消耗量 高精密度检测方法 MCF7、K562细胞模型 加入多品种、多剂量 已知细胞凋亡诱导药品 显微形态及凝胶电泳 鉴别细胞状态 不同细胞凋亡状态 标准训练集 人工制造多种不同 细胞凋亡状态的细胞 抗癌细胞药理评价新方法中药组分 传统方法 评价结果 新方法评价结
6、果 对新方法的总结评价 新方法的推广应用 化学计量学数据处理 相互比对 相互补充 技术路线 技术路线 铝染毒大鼠神经 细胞 C a s p a s e - 3 , L C 3 - I I 基因 / 蛋白表达 神经行为改变 APP、Tau 蛋白 水平 Nec-1阻 断神经细 胞坏死性 凋亡通路 与铝致痴 呆的关系 铝致神经 细胞死亡 的方式检 测 铝染毒 SD 大鼠 氧化应激水平 Nec-1和/或不同死亡通路阻断剂处理 60 岁以上铝接 触人群及对照 遗传基因多态性 检测 铝接触剂量/尿铝 含量调查 外周血淋巴细胞 M 受体表达 尿铝含量与 Caspase-3, LC3-II 蛋白表达的关系 认
7、知功能检查，MCI 诊断，AD 诊断，脑 部核磁及磁共振波 谱分析 铝致神经细胞丢失和/或 遗传因素与 MCI、AD 的 关系 尿铝含量与年龄和细胞丢 失的关系 神经细胞凋亡 /坏死/坏死性 凋亡/自吞噬 生理负荷 超负荷 基因芯片 基因芯片 基因芯片 基因芯片 激光捕获 激光捕获 生理负荷 超负荷 体外培养的成骨细胞 (OB)和破骨细胞(OC) 体外培养的成骨(OB) 细胞和破骨细胞(OC) 体内种植体骨界 面区域的骨组织 提取骨界面取材的 OB 和 OC 体外 OB、OC 基因 表达谱的时序变化 体外 OB、OC 基因 表达谱的时序变化 1、 RT-PCR 法检测 OB、OC 表达差异最大
8、的几个基因； 2、 结合基因数据库，明确“标记”基因及功能。 骨界面 OB、OC 基因 表达谱的时序变化 体内种植体骨界 面区域的骨组织 提取骨界面取材的 OB 和 OC 骨界面 OB、OC 基因 表达谱的时序变化 研究骨形成到骨吸收质的变化过 程中， 研究骨形成到骨吸收质的变化过 程中，OB、OC 基因调控机理。基因调控机理。 打靶载体 打靶载体 注射入胚泡中注射入胚泡中 植入子宫植入子宫 通过鉴定， 获得嵌合体小鼠通过鉴定， 获得嵌合体小鼠 繁殖，获基因敲除纯合体小鼠繁殖，获基因敲除纯合体小鼠 SD大鼠分组正常组、 模 型1组和模型2组各10 SD大鼠分组正常组、 模 型1组和模型2组各1
9、0 条件应激制备内脏 高敏感大鼠模型 条件应激制备内脏 高敏感大鼠模型 正正 常常 组组 腹腔注射白蛋白制备 内脏高敏感大鼠模型 腹腔注射白蛋白制备 内脏高敏感大鼠模型 正常组和模型1、2组样品的制备 正常组和模型1、2组样品的制备 DIGE试剂(Cy2、Cy3、Cy5) 标记 DIGE试剂(Cy2、Cy3、Cy5) 标记 蛋白样品的 IEF 和 PAGE 电泳分离蛋白样品的 IEF 和 PAGE 电泳分离 荧光扫描、分析差异蛋白质荧光扫描、分析差异蛋白质 胰酶对脱色后蛋白质的消化 胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱的多肽指纹图、微测序分析 健康人和IBS患者各6例结
10、肠黏膜Western Blot验证健康人和IBS患者各6例结肠黏膜Western Blot验证初步筛选出IBS差异蛋白质和分子标记物初步筛选出IBS差异蛋白质和分子标记物 差异蛋白质点的切取 差异蛋白质点的切取 生物信息学分析，获得差异蛋白质DNA序列 生物信息学分析，获得差异蛋白质DNA序列 大鼠结肠黏膜Western Blot验证 大鼠结肠黏膜Western Blot验证 筛选某个差异蛋白质进行功能研究筛选某个差异蛋白质进行功能研究 根据其 DNA 序列，按照同源重组原理，建立打靶载体 根据其 DNA 序列，按照同源重组原理，建立打靶载体 导入胚胎干细胞（ES）导入胚胎干细胞（ES） ES
11、细胞培养,以筛选发生定点重组的ES细胞 ES细胞培养,以筛选发生定点重组的ES细胞 1. 观察和检测其基因敲除小鼠生物 学特征的改变， 以明确此基因功能 观察和检测其基因敲除小鼠生物 学特征的改变， 以明确此基因功能 2. 用 AWR 评分评估此基因敲除小鼠 的内脏敏感性， 以明确此基因是否 为 IBS 的致病原因 用 AWR 评分评估此基因敲除小鼠 的内脏敏感性， 以明确此基因是否 为 IBS 的致病原因 粘膜免疫 细胞免疫 体液免疫重组乳酸杆菌测定 肠道菌群测定 免疫指标 微生态指标 仔猪 Lactobacillus 口服免疫 pMJ69-LTB-ST1 转化 pMJ69 LTB-ST1
12、融合 LTB 基因ST1 基因 连接 PCR SP 基因 pMJ68 连接 PCR Ery 敲除 EGFP 基因 pMJ67 构建携带DcR3基因 的腺相关病毒载体 体外表达鉴定、收 集 AAV 病毒颗粒 转染 从雄性近交系 Wistar 大鼠股骨、 胫骨抽取骨髓，分离、纯化 HSC 体外试验：表达 DcR3 基因的 肝干细胞抑制FasL诱导淋巴 细胞凋亡试验、抑制 FasL 诱 导的淋巴细胞趋化试验 植入 雌性近交系 Lewis 大鼠 动物实验：分别于术后 3 天、7 天、14 天、21 天、28 天取血液及肝脏标本， 采 用 常 规 生 化 法 检 测 肝 功 能 ， Northern blot、Western blot 检测 DcR3 基因在肝脏中的表达情况，免疫 组化法检测受体 CD4 +、 CD8+淋巴细胞在 供肝中的浸润情况， TUNEL 法检测供肝 中细胞凋亡情况，常规石蜡切片 HE 染 色观察移植排斥反应的发生情况 切 取 雌 性 近 交 系 Wistar 大鼠 肝脏 经门静脉注入供
