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1、病毒的细胞培养,赵健乔,一 基本原理 二 细胞培养的基本概念 三 主要优点 四 培养实验用品的前期处理 五 培养细胞的生长方式及类型 六 细胞培养的实验步骤 七 病毒的细胞培养,一 基本原理,通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增值。 在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上，置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变（CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反复冻融3次，置-70保存备用。,细胞培养的基本概念,传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养：取自体内新鲜组织
2、并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,二 主要优点, 研究的对象是活的细胞。 研究的条件可以人为的控制。 研究的样本，可以达到比较均一性。 研究的内容便于观察、检测和记录。 研究的范围比较广泛。 研究的费用相对较经济。,三 分类,原代细胞培养 传代细胞培养,原代细胞培养,概念：从供体获取组织细胞后在体外进行的首次培养。 优点：生物学特性未发生很大变化，细胞染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒学方面的实验 缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。,传代细胞培养,概念：原代细胞经过一系列传代，产生变异，转化为能够连续传代的细胞。 传代细胞可以直接从肿瘤组织
3、获得，又可以通过人工驯化获得。 常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等,四 培养实验用品的前期处理,1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿 2.包装 3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。,4.细胞培养用液及培养基（液）:,（1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.27.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。 （3）消化液 : 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为025，pH值7.2左右。需过滤除菌。 EDTA液：常用浓度为 002，配制时采用无Ca2
4、+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。,(4) 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量
5、相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子 激素 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加10血清 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量
6、最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟,（5）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细胞生命的能量来源。 （6）抗生素：最终浓度为青霉素 100 Uml，链霉素100Uml（青霉素为80万U瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加人0.5ml；链霉素为100万U瓶，将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。 （7）冻存液：二甲基亚砜 （8）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。 其是配方： 基础培养基 8090 血清 10% 双抗 100u/ml （9）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不
7、死的培养液。 其是配方： 基础培养基 95 血清 25 双抗 100u/ml,五 培养细胞的生长方式及类型, 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）,贴附生长型细胞,细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板,悬浮生长型细胞,六 细胞培养的实验步骤,1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例 （1）取胚 （2）组织处理 （3）消化 （4）分装、培养,（1）取胚,选取9-11
8、日龄SPF鸡胚，大头朝上直立于蛋架上，用碘酒、酒精消毒气室外壳。用镊子从气室端打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌平皿中。,（2）组织处理,用PBS液冲洗胚体2-3次，再将鸡胚的头、爪、内脏去除，剩下的胚体在用PBS液冲洗胚体2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀将鸡胚剪成碎块。,（3）消化,用PBS液充分冲洗组织碎块2-3次，加入3-5倍量的胰蛋白酶消化液，置37消化10分钟，每隔2-3分钟轻轻摇动一次。待组织碎块聚合成团，边缘毛样模糊时取出，轻轻吸取上层消化液，加适量DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散。,（4）分装、培养,将细胞悬液移入细胞培养瓶中，在细胞培养瓶中加入到
9、10ml DMEM，充分混匀，让细胞呈单个形式存在，最后将其放入恒温箱中培养。,2传代细胞的培养,（1）细胞的复苏 （2）细胞的传代 （3）细胞的换液 （4）细胞生长状况的观察 （5）细胞的冻存,（1）细胞的复苏,概述 复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。,操作步骤 准备好培养瓶、培养液和离心管等放于超净工作台内。 从保存液氮或低温冰箱中冻存管（安瓶）的小袋或冻存盒内取出的冻存管（安瓶）应直接投入37温水中，并轻轻摇动令其内容尽快融化。 从37水浴中取出冻存管或安瓶，离心100
10、0r1min,用酒精消毒后开启，用滴管吸出上清液，注入培养液1ml充分混匀，转入刻度离心管制成细胞悬液后低速离心，除去上清液，必要时再重复用培养液洗一次。 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入CO2培养箱静置培养，次日更换一次培养液。继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。细胞复苏时细胞数可以做1020倍稀释，接种密度以5105 ml为宜。,（2）细胞的传代,原理 在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和（细胞增值达到一定密度后），为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接
11、分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。,操作步骤 将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 用1-2ml营养液或PBS缓冲液，清洗培养瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，当看到培养瓶上含有一两个小空斑，也可看到有灰白色浑浊时，将胰酶倒掉 加入培养液，用移液管吹洗贴有细胞的一面，将细胞从培养瓶壁上吹下来 然后进行传代,消化传代的步骤,（3）细胞的换液,原理： 当细胞的量很少，未能铺满整个生长表面，但细胞培养液的pH值已经发生很大变化；或者是细胞形态很差等情况时，需要给细胞换液。,操作步骤 （1）吸弃或倒掉培养瓶内的旧培养液 （2）加入PBS溶
12、液清洗细胞瓶五面 （3）加入足量的细胞生长液，放入37、5%CO2培养箱静置培养。,（4）细胞生长状况的观察,原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了解细胞形态、数量及培养液pH值、污染与否等情况，以便采取相应的措施处理。 肉眼观察 显微镜观察,（5）细胞的冻存,传代细胞应有充足的冻存储备。 一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的绝种。 二则防止细胞因传的代次太多，造成细胞衰老或细胞发生变异。,细胞冻存方法,（1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法将细胞制成悬液并计数，800-1000r/min离心5min，弃上清。 （2）用细胞冻存液将沉淀重悬，调整细胞浓度至106-107个/ml，分装于
13、冻存管，注明细胞名称，传代及冻存日期。 （3）冷冻保存：将冻存管于4放置30min，然后移入-80超低温冰箱过夜，再放入液氮罐长期保存。亦可使用程序降温剂逐渐降温，冻存速度先为每分钟下降速度1-2，当温度达到-25时，可调整下降速度为每分钟5-10，温度降至-100时，再放入液氮罐中长期保存。,七 病毒的细胞培养,以禽流感感染鸡胚成纤维细胞为例。 （1）病料的处理 （2）病毒分离、繁殖 （3）细胞病变的观察 （4）效价测定 （5）中和实验,（1）病料的处理,采集疑是感染禽流感禽的心、脑、肺、淋巴结在含有双抗的PBS液中研磨，4过夜，3000r/min离心10min，上清通过0.22m抽滤,（2
14、）病毒分离、繁殖,1 将病毒液稀释成多个浓度分别接种在鸡胚中，鸡胚死亡后收集尿囊液。取效价最高的尿囊液接种细胞。 2 将长成单层致密的鸡胚成纤维细胞液倒掉，用PBS反复清洗3次，将死亡或脱落的细胞洗掉 3 取0.5ml处理好的禽流感病毒液注入细胞瓶内，使病毒液充分铺满瓶底,4 将接种病毒后的细胞瓶置于培养箱中感作45 min，将感作后的细胞瓶补加4.5ml营养液后置于温箱中培养 5 12h后观察细胞病变，若无明显病变，则每隔3h观察一次。当有70%细胞发生病变后，将细胞液反复冻融3次，用吸管反复吹打数次，使病毒完全从细胞中释放出来,正常形态的鸡胚成纤维细胞,接毒后发生病变的鸡胚成纤维细胞,（4）效价测定,某些病毒具有凝集某种哺乳动物红细胞的特性，利用该特性而进行的试验称为病毒的血凝试验。,
