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1、病毒滴度的测定,原理(重点)：适当稀释的病毒悬液与长成单层的宿主细胞混合，在细胞上覆以营养琼脂培养基等固体或半固体介质，由于琼脂的限制，病毒只能感染并破坏临近的细胞，造成细胞溶解而形成空斑，每个空斑由一个病毒颗粒造成，计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的病毒感染单位的浓度。,空斑形成单位法测定病毒滴度,空斑形成单位（Plaque Forming Units, PFUs),空斑显现原理(掌握)：空斑形成后，经中性红活细胞染色，活细胞显示红色，而空斑区细胞不着色，形成不染色区域。,空斑形成单位法测定病毒滴度,Procedures,适用条件(熟悉)：凡是能在细胞中产生细胞病变效应(CPE)的病毒
2、都可以采用空斑形成法测定病毒滴度。,空斑形成单位法测定病毒滴度,中性红,(掌握),(熟悉),(了解),(了解),空斑形成单位试验技术举例 p51-52 防止琼脂凝固； Hanks液？ 双抗？ 5% CO2,空斑形成单位的计算 (重点),(掌握),(熟悉),CCID50,ID50,LD50,(重点),(熟悉),5% CO2培养箱,(熟悉),CCID50,TCID50,(熟悉),病毒液 CPE孔数 无CPE 累 计 出现CPE孔 稀释度 孔数 CPE孔数 无CPE孔数 所占的% 10-1 8 0 27 0 100（27/27） 10 -2 8 0 19 0 100（19/19） 10 -3 7 1
3、 11 1 91.6 （11/12） 10 -4 3 5 4 6 40（4/10） 10 -5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10 -6 0 8 0 21 0（0/21）,Reed-Muench法计算CCID50,CPE(阳性)孔累计数由下向上累积 无CPE(阴性)孔累计数由上向下累积,(难点、重点),CCID50,(难点、重点),Calculation of TCID50,Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well),Karber法计算CCID50,(难点、重点),lgCC
4、ID50=L+d(s-0.5) L: 病毒的最低稀释倍数的对数 L=lg10-1 = -1 d：稀释系数，即组距 d=lg10-1 = -1 S：CPE(阳性)孔比率总和 lgCCID50=(-1) + (-1)(3.375-0.5) =-3.875 CCID50=10-3.875/0.1ml,ID50 和 LD50 的计算与CCID50完全相同(掌握) lgCCID50=L+d(s-0.5) ID50 计算，S：感染比率总和； LD50 计算，S：死亡比率总和；,(掌握),血凝试验的基本原理(掌握),红细胞凝集现象(血凝现象) 红细胞凝集抑制 (红细胞与抗体结合，失去血凝) 血凝滴度/血凝单位,血凝试验测定病毒滴度,干扰滴定测定病毒滴度,小结 主要介绍空斑形成单位法、50%终点法、血凝试验和干扰滴定法测定病毒滴度的原理及其方法； 重点要掌握空斑形成单位法、50%终点法测定病毒滴度的原理及其滴度的计算； 熟悉：空斑形成单位法、50%终点法、血凝试验和干扰滴定法测定病毒滴度的具体方法；,
