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1、第四章 病毒的侵染与复制,第一节 病毒复制研究的实验系统 第二节 病毒的复制周期 第三节 病毒的异常复制 第四节 朊病毒,本章重点,1.烈性噬菌体繁殖的一般过程 2.一步生长曲线 3.病毒核酸的复制 4.朊病毒的复制与致病机理,复制（replication）:病毒感染细胞后，在病毒核酸控制下合成病毒的核酸与蛋白质等成分，然后在宿主细胞的细胞质内或核内装配成病毒颗粒，再以各种方式释放到细胞外，感染其他细胞，这种增殖方式叫复制。,第一节 病毒复制研究的实验系统,一、噬菌体细菌培养系统 1、细菌容易培养，数目易于控制。 2、形成噬菌斑容易观察。 3、实验重复快。 其相关研究为植物病毒和动物病毒的复制
2、所借鉴。,二、噬菌体(phage)的繁殖,噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合成和装配，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所以一般将噬菌体的繁殖称做复制。 根据噬菌体与宿主的关系： 烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体. 温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。,烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段： 吸附、侵入、复制、装配和释放。,1、烈性噬菌体的繁殖,吸附：噬菌体和宿主细胞上的特异性吸附部位进行特异性结合，噬菌体以尾丝牢固吸附
3、在受体上后，靠刺突“钉”在细胞表面上。 侵入：核酸注入细胞的过程。噬菌体尾部所含酶类物质可使细胞壁产生一些小孔，然后尾鞘收缩，尾髓刺入细胞壁，并将核酸注入细胞内，蛋白质外壳留在细胞外。 复制 ：包括核酸的复制和蛋白质合成。噬菌体核酸进入宿主细胞后，会控制宿主细胞的合成系统，然后以噬菌体核酸中的指令合成噬菌体所需的核酸和蛋白质。,装配： 主要步骤有： DNA分子的缩合通过衣壳包裹DNA而形成头部尾丝及尾部的其它部件独立装配完成头部与尾部相结合最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。,释放： 方式： 裂解：包括T4噬菌体在内的大多数噬菌体以裂解细胞的方式释放。 分泌：噬菌体
4、穿出细胞，细胞并不裂解。（丝状噬菌体） 通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合成100300个噬菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长，,2、一步生长曲线 一步生长曲线是定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。 （1）实验设计依据： 通常噬菌体和细菌的混合比例为1:10，保证1个菌体只被1个噬菌体感染,避免二次吸附；细菌群体被噬菌体同步感染。,（2）实验过程: 敏感菌10ml Phage 1ml 混匀，5min,使之吸附 离心或用抗phage血清处理, 去除过量phage 高倍稀释,吸附phage的菌悬液(避免多次吸附) 37培养,定时取样,噬菌斑: 概念：将少量噬菌体与大量敏感菌
5、混合培养在营养琼脂中，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上,可以用肉眼看到一个个透明的不长菌的小圆斑，称为噬菌斑。(每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。) 应用: 噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。,噬菌斑,取样人为裂解处理（每5min） 样品中加入氯仿裂解细胞,24-48h,裂解液加入敏感菌液中,适当稀释混合液,涂布于琼脂培养基上,计数噬菌斑,取样（每5min） 离心除去细菌 上清加入敏感菌液中 适当稀释混合液 涂布 计数噬菌斑,以培养时间为横坐标,以噬菌斑数为纵坐标,绘制成的曲线为一步生长曲线。 可分以下阶段： 潜伏期 (latent phase) 裂解期 (burst
6、phase) 稳定期 (plateau phase),一步生长曲线,一步生长曲线,潜伏期：从噬菌体吸附细菌到细菌细胞释放新的噬菌体之前的这段时期。曲线平行于横轴，噬菌体数无变化。样品中无游离的噬菌体。(潜伏期前的噬菌斑数是噬菌体数,也就是感染噬菌体的细菌数). 病毒在感染细胞内消失到细胞内重新出现新的感染病毒的时期为隐蔽期(eclipse period)。 裂解期：曲线直线上升，子代噬菌体不断释放到培养基中,直到达到一个极限。 稳定期:感染细胞后复制的子代噬菌体全部释放，噬菌斑数稳定，一次感染结束。,裂解量:每一受感染细胞所释放的新的噬菌体的平均数。 稳定期噬菌斑数 裂解量 = 潜伏期噬菌斑数
7、 不同的噬菌体或同种噬菌体感染敏感菌后所释放的噬菌体数不同，与噬菌体种类、宿主细胞菌龄以及环境因数有关。 T4约为100，X174约为1000，f2高达10000、T2仅为200。,MOI :multiplicity of infection，感染复数。 传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。,3、温和噬菌体与溶源性细菌,温和噬菌
8、体(temperature phage)：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。 原噬菌体（或前噬菌体,prophage）： 即整合在宿主核DNA上的噬菌体的核酸。 溶原性细菌(lysogenic bacteria)：指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖，而不被裂解。,溶原性细菌的特点： 可稳定遗传：子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性。 可自发裂解：温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率10-210-5 。
9、 可诱导裂解：用化学、物理方法诱导 具有“免疫性”：溶原菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源的噬菌体不敏感，对同源噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体没有免疫性。 可复愈：自然遗失前噬菌体，但不发生自发裂解和诱导裂解 溶源转变：由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一些新的生理特征。,三、动物病毒动物细胞培养系统 20世纪50年代才建立动物细胞体外连续培养技术。体外培养细胞只能近似地反应动物机体内病毒的复制过程。 空斑方法 相当数量的病毒不能在细胞培养物中生长,植物细胞去掉细胞壁，而仍有代谢活性的原生质部分称为原生质体，20世纪70年代建立。 原生质体的离体存活能力、生理活性不十分理想，有些植物
10、原生质体的分离、培养与维持还十分困难。目前尚不如动物细胞那样成熟和方便。,四、植物病毒植物原生质体培养系统,第二节 病毒的复制周期,一、吸附(adsorption),病毒与细胞表面特异的受体结合称为吸附。 病毒与细胞的最初结合是可逆的。 病毒与受体结构互补后，形成不可逆结合，这时即使洗下病毒颗粒，该颗粒也不具有侵袭性。,决定病毒不可逆结合的因素,1、病毒吸附蛋白 能够识别并吸附细胞表面受体的病毒表面结构蛋白。 T-偶数噬菌体的吸附蛋白是噬菌体尾丝蛋白。流感病毒包膜上有两种突起：血凝素和神经氨酸酶，但病毒的感染性只能被抗血凝素的抗血清中和。,流感病毒外面两种蛋白质突起，一是血凝素，一是神经氨酸酶
11、。病毒血凝素对细胞上含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白有特异的亲和能力。神经氨酸酶与细胞表面黏液蛋白中的神经氨酸也有特异的结合能力，它的作用是从黏液蛋白释放乙酰神经氨酸，因而使得由细胞表面芽生的子代病毒，得以脱离细胞。,2、病毒的细胞受体,病毒的细胞受体决定了病毒的宿主范围、组织亲和性、并影响病毒的致病性。细胞的生理状态发生改变，也会影响病毒的吸附。,例如脊髓灰质炎病毒只能附着在灵长类的动物细胞上，而不能吸附在啮齿类动物细胞上。 脊髓灰质炎病毒的RNA + 柯萨奇病毒的蛋白质衣壳 杂种病毒 侵染小鼠细胞,噬菌体细胞受体有严格的种系特异性，因而各种噬菌体具有严格的宿主范围，这一特性可作为细菌的分类鉴定指标
12、。,大多数噬菌体的病毒受体为细菌细胞壁上的磷壁酸分子，脂多糖分子以及糖蛋白复合物，有的则位于菌毛、鞭毛或荚膜上。大部分动物病毒的病毒受体为镶嵌在细胞膜脂质双分子层中的糖蛋白，也有的是糖脂或唾液酸寡糖苷。植物病毒迄今尚未发现有特异性细胞受体。,植物病毒,植物病毒须经机械传递或昆虫介体传递导致感染。不存在吸附蛋白和受体的特异结合，其特异性取决于病毒复制过程的以后各步。,不侵染番茄TMV株系的RNA+侵染番茄TMV株系的外壳 杂种病毒 不侵染 侵染番茄TMV株系的RNA+不侵染番茄TMV株系的外壳 杂种病毒 侵染,3、环境因数,温度：一定温度范围内，病毒的吸附速率与温度成正比。 脊髓灰质炎病毒在1时
13、的吸附率仅是37 的十分之一。 离子环境：病毒的吸附蛋白与细胞受体主要成分是蛋白质，趋向带负电荷。一般一定浓度的阳离子促进吸附，阴离子无此作用。 pH：影响病毒与细胞吸附反应的第一步-静电引力结合。,二、侵入（penetration）,1、噬菌体的侵入 T偶数噬菌体采取注射的方式 其他噬菌体的入侵方式可能不同。,2、动物病毒的入侵,（1）位移：一些裸露的病毒，如脊髓灰质炎病毒在吸附到细胞膜上后壳体发生改变，以便只有核酸进入细胞。 （2）与细胞膜融合：副黏病毒（有囊膜病毒） （3）内吞作用：又称病毒胞饮，呼肠孤病毒、乳多空病毒。（有囊膜及无囊膜病毒）,3、植物病毒,（1）介体感染：主要通过昆虫。
14、 （2）非介体感染：即带毒植物的嫁接，带毒花粉的花粉粒萌发，芽管侵入胚胎等均可使病毒进入细胞。,三、脱壳,病毒侵入细胞后，病毒的包膜和衣壳被除去而病毒核酸释放出来的过程。大部分依靠细胞内的蛋白酶进行脱壳，也有病毒表达脱壳酶。,四、病毒大分子的合成,病毒感染细胞后，要么潜伏下来将核酸整合于细胞基因组，成为前病毒随细胞分裂而传递； 要么接管细胞的代谢机制，利用细胞合成核酸和蛋白质的原料、场所、机制、能量完成病毒大分子的合成。,大多数正链RNA病毒的RNA分子直接与核糖体结合，全长或部分进行翻译。其他病毒基因组均需转录为mRNA，再进行蛋白表达。在细胞核内复制的DNA病毒通过细胞的DNA依赖的RNA
15、聚合酶执行转录功能，其他病毒则需由病毒编码独特的转录酶，作为病毒的中间产物。,病毒大分子的合成包括核酸的复制和基因组的转录。病毒基因组的转录具有严格的时序性，分早期转录和晚期转录。 发生在病毒核酸复制以前的转录为早期转录，转录的基因为早期基因，早期蛋白主要参与病毒核酸的复制以及参与抑制宿主细胞大分子的合成。 在核酸复制开始或复制后进行的转录称为晚期转录，晚期蛋白主要是病毒的结构蛋白。,1、病毒核酸复制概论,（1）病毒核酸的复制模式： 半保留复制和全保留复制。 1）半保留复制： 在新复制的dsDNA中，一条是母体DNA链，另一条是新合成的子代DNA链。是DNA复制普遍遵循的模式，DNA病毒也大多
16、采用此种方式。但也有一些dsRNA病毒采用。,半保留复制,2）全保留复制 主要是dsRNA病毒，复制时双链基因组仍相互缠绕，只在复制点局部解开几个碱基对，子代双链全是新合成。包括呼肠孤病毒、质型多角体病毒、轮状病毒等。在+ssRNA噬菌体基因组复制时所形成的复制型RF复制子代+RNA链时也存在这种模式。,全保留复制,（2）病毒核酸复制的主要类型：7类,1971年，Baltimore D根据病毒基因组的复制表达线路，提出了一种分类方法。 （+）DNA,后来，学术界将嗜肝DNA病毒科和花椰菜花叶病毒科另列一组，这类病毒的dsDNA复制必须经过逆转录产生DNA(前基因组),第一类型：dsDNA 1）仅在细胞核内复制（疱疹病毒科
