《药品微生物检验特点及过程控制中检所马仕洪教学案例》由会员分享，可在线阅读，更多相关《药品微生物检验特点及过程控制中检所马仕洪教学案例（48页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、药品微生物检验特点 及过程控制,中国药品生物制品检定所 马仕洪 2010年5月26日 上海,web site: e-mail:mash tel:010-67095509,地址：北京市天坛西里2号 邮编：100050,中国药品生物制品检定所,2,药品微生物检验特点及过程控制,药品因素 环境影响 培养观察 抽样检查 破坏试验,方法验证,过程控制,中国药品生物制品检定所,3,无菌/微生物限度检查理念,中国药品生物制品检定所,4,微生物检查的过程控制,一、实验设施（硬件物质保障） 二、检验程序（软件有效的结果） 三、结果判断（调查可靠的结论）,中国药品生物制品检定所,6,（一）、实验室系统,洁净实验条
2、件 有效性：整体10000级、局部100级。 安全性：保护样品、人员和环境。 可操作性：方便、快捷、顺畅。 洁净实验条件的维护、验证 阳性菌实验室达到P2生物安全标准,中国药品生物制品检定所,7,实验室改造示例：原布局图 拟定布局图 建议布局图1 建议布局图2 实验室系统中检所微生物实验室,中国药品生物制品检定所,8,（一）、实验室系统,实验室系统的管理与维护： 1、屏障系统的有效性 压差、风速、微粒、照度 （外包服务合同） 2、清洁、静态与动态监控、熏蒸 3、环境菌库 酒精棉球分离微生物 新洁尔灭分离微生物,中国药品生物制品检定所,9,环境菌库,洁净环境常见菌（浮游菌）： 头状葡萄球菌（St
3、aphylococcus capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）,中国药品生物制品检定所,10,（二）、操作环境,1、隔离器 2、生物安全柜 3、超净工作台,中国药品生物制品检定所,11,（二）、操作环境,中国药品生物制品检定所,12,搽拭,菌液稀释、分液的误差为：5.5% 表面搽拭操作的回收率大于 99%,中国药品生物制品检定所,13,（三）、关键设备,微生物检查薄膜过滤仪 一次
4、性薄膜过滤培养器 应急检验用一次性薄膜过滤培养器,中国药品生物制品检定所,14,（四）、对照培养基,培养基适用性（灵敏度）； 培养基性能稳定性（标准化）。,对照培养基,理化评价（可控性）,生物学评价（有效性）,回收率比较,MPN比较,生长曲线比较,生态评价,某些CRS原则,固态培养基,液态培养基,琼脂加减法,中国药品生物制品检定所,15,二、检验程序,中国药品生物制品检定所,16,二、检验程序,接受任务 实验方案 实验准备 样品核对 实验操作 过程监控 培养观察,有效的结果,物 质 保 障,中国药品生物制品检定所,17,实验室管理规范（软件）,中检所抗生素室微生物实验室质量管理体系 编写说明及
5、批准页 1 实验室概况 1.1 实验室简介 1.2 实验室通讯资料 1.3 实验室认可项目/参数表 1.4 实验室平面图及功能区域 1.5 仪器设备总览 1.6 常备试剂耗材一览表 1.7 实验室发展目标 2 管理规范 2.1 安全管理 2.2 业务流程 2.3 人员管理（6个SOP） 2.4 样品管理（3个SOP） 3 标准操作规程 3.1 检验工作SOP（13个） 3.2 仪器操作SOP（30个） 3.3 实验记录SOP（9个） 4 实验室保障 4.1 实验室设施、设备及消耗品供应商确定原则 4.2 实验室设施服务商 4.3 实验设备供应商 4.4 实验室消耗品供应商,中国药品生物制品检定
6、所,18,（一）、实验准备,实验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备无患，应随时保证“来之能战” 。 尤其注意常备有效期要求的物品：培养基、冲洗液、滤器、小型实验器材等。,中国药品生物制品检定所,19,实验准备无菌室专用酒精棉球制备 实验准备场地清洁 实验准备台面清洁,中国药品生物制品检定所,20,（二）、样品核对,尽快取得样品，确保样品传递过程中的完整性、安全性、有效性； 仔细核对样品及样品资料，高度关注媒体公布样品（问题样品），同时尽量获取非问题样品及同类样品，进行比较实验、比较分析； 样品外观检查、完整性检查。,中国药品生物制品检定所,21,样品外观检查欣弗 样品外观检查刺五加 样品外观
7、检查双黄连 样品完整性真空检漏,中国药品生物制品检定所,22,（三）、实验操作,不断完善标准化操作规程（SOP），严格避免实验室污染。,药品食品生产过程中可能污染微生物的主要环节,药品食品微生物检查过程中可能污染微生物的主要环节,中国药品生物制品检定所,23,实验操作物料进场,消毒液搽拭物品外表面,洁净传递（风淋、紫外照射）,双层无菌包装,核心区,外围,实验操作人员进场,一更,二更,核心操作区,实验操作无菌操作技术,中国药品生物制品检定所,24,（四）、实验过程监控,样品监控,手指监控,沉降菌监控,无菌检验框架示意图,中国药品生物制品检定所,25,三、结果判断,长菌与否 分离鉴定 溯源调查 结
8、果报告,可靠的结论,有效的结果,物 质 保 障,中国药品生物制品检定所,26,三、结果判断,是不是微生物？ 是什么微生物？ 微生物来自哪里？ 几点思考 参见：FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验洁净室环境菌的相似性考 察药学学报，2007，42（11）：11891194 判断无菌检查阳性结果有效性的实验探讨药物分析杂志， 2008， 28（05）：6671,中国药品生物制品检定所,27,1、长菌与否？,浑不浑浊? 物理变化、化学变化还是生物变化？,一靠经验 二靠实验 三靠严格程序控制避免干扰,中国药品生物制品检定所,28,是不是微生物？,（1）、液体培养基浑浊 物理变化？化学变化？生物学变
9、化？ （2）、平板上的菌落 琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层 菌落or药渣？,中国药品生物制品检定所,29,菌落or药渣？,经60Co射线大剂量照射再检验 延长培养时间到7天 重新划线培养 镜检,中国药品生物制品检定所,30,2、分离鉴定,（1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中继续培养； （2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，-80保存； （3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线，分离污染微生物； （4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴定，并逐一保藏。,中国药品生物制品检定所,31,是什么微生物
10、？,宏观：生长形态 微观：镜检 鉴定：生化鉴定（API、BD） 核酸鉴定（16sRNA、DNA） ,中国药品生物制品检定所,32,3、溯源调查,样品阳性培养物分离菌株 检验过程监控菌株 环境菌（近期、远期） 现场调查收集菌株,鉴定与相似性分析相结合,传统方法与新技术相结合,不同方法的交叉验证,中国药品生物制品检定所,33,微生物来自哪里？,相似性分析 同源性分析 脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR）,中国药品生物制品检定所,34,Sample Preparation,Automated measurement after drying of the samples!,2. Suspe
11、nding,1. Harvesting,3. Loading,FT-IR Spektrum of microorganisms,图 不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系,中国药品生物制品检定所,35,The Infrared Spectrum,FT-IR spectrum is a fingerprint of the cells,Biochemical Structure of Cells,中国药品生物制品检定所,36,中国药品生物制品检定所,37,溯源性分析例1欣弗事件,图29 欣弗培养物,图30 欣弗培养物分离菌株镜检,中国药品生物制品检定所,38,中国药品生物制品检定所,39,溯源性分
12、析例1欣弗事件,头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcus capitis ssp capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcus cohnii ssp cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）。,监测到的环境菌株,中国药品生物制品检定所,40,溯源性分析例2,双黄连注射液,利巴韦林注射液,FTIR相似性分析,DuPont RiboPrinte
13、r基因指纹分析,中国药品生物制品检定所,41,几点思考,（1）、怎样才算是同一株菌？ 需要深入认识微生物本身 微生物变异与保守的相对性； 分析方法的可变性与微生物本身的可变性； 生物学先锋琳恩马古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果将一个特殊的质粒植入大肠杆菌，大肠杆菌便会突然间变成克雷伯氏杆菌”。,中国药品生物制品检定所,42,几点思考,（2）、什么是最适宜的技术？ 需要深入认识分析微生物的技术和手段 形态学分析与相似性分析（生化反应谱、片段相似性、FTIR光谱相似性等），在权衡方法本身的边界和微生物变异性边界的基础上，似乎更适合对亲缘关系下一个否定的结论，即排除法，在这个意义上
14、是否可以引入化学分析的3概念、精密度概念？,中国药品生物制品检定所,43,4、几点思考,（2）、什么是最适宜的技术？ 16sRNA cDNA序列，需要研究，太保守不利于区分；变异率太高（高到普通传代、培养难以控制）则没有意义。但一般来说16sRNA cDNA序列水平具有确定意义，困难在于确定足够长。 溯源分析不仅仅是鉴定到种，而是到株，对菌株的稳定性认识？与之相关的技术粗放性问题。,中国药品生物制品检定所,44,4、几点思考,（3）、怎样下结论？ 分析的根本目的是要下一个结论 以检验活动为中心、以检验过程为线索、以实 验事实为依据，根据所有信息的综合分析能力。 对阳性检出菌的技术分析最终要回到检验活动本身，技术分析结论,中国药品生物制品检定所,45,4、结果报告,综合分析 慎下不合格结论 不放过任何一个阳性信息,中国药品生物制品检定所,46,无菌/微生物限度检查理念,中国药品生物制品检定所,47,实验操作的标准化 验证试验的系统化 制定标准的严谨化 完备的实验室保障系统 最终目标：一次检验即可得到准确结果。,中国药品生物制品检定所,48,谢谢大家！,
