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1、第三课时提取DNA师:DNA并不神秘，我们可以从一些生物材料中把它提取出来。师:我们可以从哺乳动物成熟的红细胞中提取DNA吗？生:不可以，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，而DNA主要是存在于细胞核里的。师:我们可以根据什么原理，用哪些方法可以将细胞中的DNA提取出来呢？板书：探究题目：DNA的粗提取实验原理(1) DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。(2)DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以
2、进一步提取出含杂质较少的DNA。实验用具鸡血细胞液(510 mL)；体积分数为95%的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol/L和0.015 mol/L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯(100 mL,1个， 50 mL、500 mL，各2个)，漏斗，试管(20 mL,2个)，玻璃棒，滴管，量筒(100 mL,1个)，纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。课前准备制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500 mL烧杯中，注入新鲜的鸡血(约180 mL)，用玻璃棒搅拌，使其充
3、分混合，以免凝血。静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。也可以用离心机离心2 min(转速1000转/分)。用吸管吸去上清液。实验步骤(1)提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，搅拌速度稍快，稍重，时间为5 min。(2)溶解DNA。(3)析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300 mL，逆时针方向搅拌，搅拌速度缓慢。(4)用玻璃棒将丝状物挑起，获得含有一定杂质的DNA。板书：实验过程(1)教师:指导学生阅读文本实验步骤2、3、4、5；要求学生要严格按照实验指导的方法步骤去操作。(2)教师:巡视，指导，让学生思考每一操作步骤要达到什么目的。实验分析师:在进行步骤(1)时，需要搅拌5分钟。那么，为什么要加蒸馏水
4、？生:让细胞内溶液的浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破。师:为什么要用力搅拌？生:可以加速血细胞和细胞核的破裂。师:那么，要得到DNA，下一步该如何操作呢？生:下一步骤是通过过滤，将细胞膜和核膜等物质滤去，得到含DNA的滤液。师:步骤(4)是这个实验成败的关键，该如何加蒸馏水？使用玻璃棒该注意什么？为什么？生:加蒸馏水应该沿着烧杯内壁缓慢加入；玻璃棒应该沿着一个方向轻轻地搅拌，千万不能太快太猛；目的是防止打碎DNA。师:观察你滤取出来的黏稠物是什么颜色？生:浅黄色。师:有的同学提取的黏稠物较少，原因是什么？生:可能是在溶解DNA时不充分；也可能是析出黏稠物时搅拌得快了；还可能是步骤(4
5、)中，没有等到黏稠物不再增加时停止搅拌，而是过早或过晚停止搅拌了。师:(1)实验中两次都需要加入蒸馏水，两次加入蒸馏水的作用相同吗？(2)如果要进一步纯化上述含有杂质的DNA，应该怎么做？生甲:两次加入蒸馏水的作用不相同。第一次加入蒸馏水目的是为了使血细胞胀破；第二次加入蒸馏水目的是稀释NaCl溶液直至浓度为0.14 mol/L，以析出DNA。生乙:因为DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。(本探究建议在课堂中完成。)板书：探究题目：提取出含杂质较少的DNA，并鉴定DNA。设计实验(1)接着上面实验步骤进行。(2)再用2
6、 mol/L的NaCl溶液溶解黏稠物：顺时针方向搅拌，较慢，时间为3 min。(3)过滤上述溶液：取滤液。(4)在上述滤液中加入体积分数为95%的冰酒精；并用玻璃棒沿逆时针方向搅拌，速度稍慢，时间为5 min，析出含杂质较少的DNA。(5)DNA的鉴定：取两支试管，各加入物质的量为0.015 mol/L的NaCl溶液，将丝状物放在其中一支试管，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺，沸水浴5 min。实验步骤实验交流师:为何将黏稠物再溶解时一定要充分搅拌？生:以免有DNA损失。师:加入冷酒精时动作要慢。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌。至不再增加时，取出吸干上面
7、的水分。仔细观察丝状物呈什么颜色？生:黄色。师:这些丝状物要用二苯胺鉴定。使用二苯胺时要注意不要接触到药液。进行沸水浴时，在实验室较为通风的地方集体进行。师:现在大家从水浴锅中拿出试管，比较两支试管中溶液的颜色有什么不同？生:有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色。师:这一鉴定结果说明什么问题？生:提取出的丝状物中有DNA。师:那么你看到的丝状物的粗细是不是DNA分子的直径呢？生:不是。DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA分子聚在一起形成的。本节课结束了，下面请同学们将实验用具，按原样摆放整齐，实验桌要保持清洁。课下将实验报告册填好。一、DNA粗提取1实验原理2实验步骤(1)提
8、取鸡血细胞的细胞核物质(2)溶解细胞核内的DNA(3)析出含DNA的黏稠物二、鉴定DNA过滤再溶解过滤提取含杂质少的DNADNA的鉴定。1解析：这两组数据能说明染色体是DNA的主要载体，染色体主要由DNA和蛋白质组成。答案：B2解析：DNA中含有磷元素，氨基酸中含硫元素无磷元素，噬菌体侵染细菌后利用细菌的氨基酸和核苷酸装配成大量的子病毒。所以可在噬菌体内发现磷元素。答案：B3解析：为了使DNA从细胞核中释放出来，实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说，是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞破裂。在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 mol/L
9、 )中，核蛋白容易解聚，游离出DNA。第二次加入蒸馏水目的是稀释NaCl溶液直至浓度为0.14 mol/L以析出DNA。答案：(1)稀释鸡血细胞溶液溶解DNA(2)0.14 mol/L1实验原理的补充介绍(1)DNA的释放DNA位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来，实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说，是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞破裂。同时，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，于是释放出DNA，当然也有RNA。但是，释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在
10、一起。(2)将DNA与蛋白质分离根据二者的特性，即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 mol/L )中，核蛋白容易解聚，游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高，Na与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。(3)DNA的析出与获取利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理，向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水，稀释氯化钠溶液，使DNA的溶解度下降，而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象)，从而使二者分离。这时，加上不停地搅拌，溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤，滤去蛋白质，就可以获取DNA的黏稠
11、物了。如果采用离心法则更好，用4 000 r/min的旋转频率，离心15 min ，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含DNA。(4)DNA的再溶解再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。(5)DNA的沉淀和浓缩除去了蛋白质的核酸溶液，必须再进一步沉淀和浓缩。最常用的方法是酒精沉淀法。就是将含有Na的DNA溶液，加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中，混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物，悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少，可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分钟。浓缩后的DNA丝状物，可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。
12、(6)DNA的鉴定本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法(配方见下述的“药品配制”)。二苯胺法的原理是：DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成羟基酮基戊醛，它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。(7)二苯胺试剂的配制A液：15 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中，再加15 mL浓硫酸，用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态，则需加温后待其熔化，再使用。B液：乙醛的体积分数为0.2%的溶液。配制：将0.1 mL B液加入到10 mL A液中，现配现用。2DNA粗提取与鉴定的另一种方法材料用具：新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。塑料烧杯，量筒，玻璃棒，尼龙纱布
13、，陶瓷研钵，试管，试管架，试管夹，漏斗，酒精灯，石棉网，三角架，火柴，刀片，天平。研磨液，体积分数为95%的酒精溶液，二苯胺试剂，蒸馏水。方法步骤：(1)DNA的粗提取准备材料将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室，至少24 h。取材称取30 g菜花，去梗取花，切碎。研磨将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min。过滤在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1 000 r/min的旋转频率，离心25 min，取上清液放入烧杯中)。在4 冰箱中放置几分钟后，再取上清液。加冷酒精将一倍体积的上清液倒入两倍体积的
14、体积分数为95%的冷酒精溶液中，并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。沉淀35 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，絮状物会缠在玻璃棒上。(2)DNA的鉴定配制二苯胺试剂取0.1 mL B液，滴入到10 mL A液中，混匀。鉴定取4 mL DNA提取液放入试管中，加入4 mL二苯胺试剂，混匀后观察溶液颜色(不变蓝)。用沸水浴(100 )加热10 min。在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色)。研磨液的配制方法：Tris：10.1 g(相对分子质量为121.14)，先加50 mL蒸馏水溶解，用物质的量浓度为2 mol/L的盐酸调至pH8
15、.0，再加下述药品：NaCl：8.76 g(相对分子质量58.44)；EDTA：37.2 g(相对分子质量372.24)；SDS：20 g(相对分子质量288.3)。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1 000 mL。若在室温低于20 时配制药液，SDS呈沉淀析出，此时需要加温，才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀，则应加温使沉淀溶解后再使用。研磨液中几种药品的作用：SDS(十二烷基磺酸钠)：可使蛋白质变性，与DNA分离。EDTA(乙二胺四乙酸二钠)：为DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。物质的量浓度为0.15 mol/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA。Tris/HCl：提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。(Tris为三羟甲基氨基甲烷)3鉴定DNA的其他方法用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好。具体鉴定方法如下：(1)配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液。(2)将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。(3)将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室
