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1、,植 物 细 胞 工 程 plant cell engineering,植物细胞的构造,第一章：绪论 第二章：第二章 植物细胞的全能性及其表达 第三章：体细胞胚发生的细胞生物学基础 第四章：植物细胞及组织培养 第五章：原生质体培养和细胞杂交 第六章：植物单细胞培养和次生物质生产,主 要 内 容,主要参考书,崔凯荣，戴若兰主编：2000,第一章 绪 论,1-1 植物细胞工程的概念和任务 一.基本概念 以植物细胞为基本单位在体外条件下进行培养、繁殖 和人为操作，改变细胞的某些生物学特性，从而改良品种 加速繁育植物个体或获得有用物质的技术。,二.植物细胞工程的研究内容,1、细胞培养(Cell Cul
2、ture)：单细胞或小的细胞团(67个细胞)、花粉及花药、原生质体（Protoplast Culture）等。 2、胚胎培养(Embryo culture)：Ovule、幼胚、成熟胚、Endosperm的离体培养。 3、组织培养(Tissue culture)：根组织、茎组织、叶肉组织、中柱鞘、形成层、髓组织、贮藏薄壁组织（大蒜瓣、洋葱鳞茎、百合鳞片）、 珠心组织等。 4、器官培养(Organ culture)：Root、Shoot、Leaf、Flower、Fruit以及各部原基(芽原基、根原基)的培养。 5、细胞改造：细胞拆分、染色体转移、基因转移。,三.植物细胞工程研究的任务,1、研究植物
3、器官、组织和细胞在离体培养条件下,所需要的有机营养、无机营养、植物激素等营养条件；所需的光、温、氧等环境条件组培快繁、单倍体育种、抗性细胞系的诱变筛选、原生质体培养、细胞杂交、超低温冷冻贮藏种质保存、人工种子制造和细胞改造等,2、研究不同生理年龄、遗传组成(基因型)的外植体在离体培养条件下进行形态发生的规律植物生理生化、遗传、发育生物学机理等研究，最终获得转基因植物及其产品。,3、研究离体培养条件下再生植株群体的遗传稳定性和变异性脱毒与快繁,4、培养细胞生长与产物合成动力学研究细胞规模化培养与工业化生产。,目前，在学科分类与代码中，细胞工程采用(18. 7120)为代码；国家自然科学基金委则用
4、(C010904) 作为“细胞工程”学科的代码。,微生物学,生物物理学,胚胎学,思考题：,1植物细胞工程的研究内容包括哪些方面？ 2未来植物细胞工程研究的任务将涉及哪些方面？,第二章 植物细胞的全能性及其表达,2-1 植物细胞全能性(Totipotent) 一、概念 植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性,在一定条件下如 同受精卵一样,具有发育成完整植物体的潜在能力。 (1)植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞,均具有该物种全 部的遗传信息。 (2)每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能力。,二、全能性实现的基本方式,1、生命周期：以裸孢子体和配子体的世代交替来实现； 2、细胞周期：DNA复制、
5、转录mRNM并翻译为蛋白质，使细胞全能性得以形成和保持。 3、组织培养周期：在离体培养条件下通过细胞脱分化与再分化来实现全能性。,三.离体条件下全能性实现的基本途径,（一）细胞脱分化和再分化的概念 细胞脱分化(Dedifferentiation),即失去已分化细胞的典型特征,或消除了细胞分工,使之回复到分生组织状态,或胚性细胞状态,即细胞脱分化。 细胞再分化(Redifferentiation)即在离体培养下,重新恢复细胞分化能力,并经历器官发生和胚胎发生，形成单极性的芽、根或形成双极性的胚状体(Embryois),进一步发育成完整植物体的过程。,植物细胞脱分化和再分化示意图,（二）植物细胞脱
6、分化和再分化的条件,1、机械隔离与生理隔离 把器官、组织或细胞从整体植物上分离下来。 作用：脱离整体,消除整体遗传信息的制约。 意义：促进细胞、组织和器官的脱分化，使“全能性”得以表达。,2、植物激素的作用,生长素的作用 促进胞质分裂，启动细胞分裂。 机理：它与含精氨酸高的组蛋白结合,使一部分受阻遏的基因解除抑制状态而活化,从而恢复转录(合成mRNA)和转译, 最终形成酶和蛋白质。,细胞分裂素的作用: 促进RNA合成与核分裂，使已经脱分 化的细胞或细胞团保持持续有丝分裂。 机理：作为tRNA反密码子附近的一个 碱基组分,并由此控制特殊mRNA的合成来 促进细胞的分裂。, 2,4-D的作用 促进
7、培养细胞的脱分化和愈伤化。,2-2. 细胞极性与胚状体,一、细胞极性（polarity） 是指细胞、器官和植株的两个极端在形态结构和生 理生化上存在差异的现象。主要表现在细胞质浓度的差 异、细胞器数量的多少、核位置的偏向等方面。极性的 建立会引发不均等分裂。 极性是细胞分化的前提。,荠菜胚的形成,A、B 受精卵的第一次不均等分裂；CH胚与胚柄的形成；I球状胚；J、K 由于球状胚处的胚细胞垂周分裂，形成心形胚出现叶和根的分化，近胚柄侧形成胚根；L鱼雷形胚；M 成熟胚，具有子叶、胚根、胚芽，胚内有维管束(Sinnott,1960).,墨角藻受精卵极性建立过程,A、未分化的合子；B、极性尚未稳定的合
8、子；C、极性的合子；D、胚胎,二、胚状体,1、胚状体的概念 离体培养条件下胚状体起源于一个非合子细胞，它经历 胚胎发育过程所形成的类胚结构。 胚状体是离体培养的产物，仅限于离体培养范畴内使 用，区别于无融合生殖的胚。 胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚； 胚状体的形成经历与合子胚相似的发育过程， 从球 形胚、心 形胚、鱼雷胚到成熟胚，它区别于离体培养时 分化的芽体。,2、胚状体的类别, 体细胞胚： 来源于根、茎、叶以及它们的组织和细胞，经离体培养而发生的类胚结构。其染色体组为两套，可发育成正常可育的植物体。 三倍体胚： 来源于胚乳细胞的胚状体，具有三套染色体组。如巴豆、蓖麻、桃等。三倍体植物
9、具有不育性。,生殖细胞胚：,来源于大孢子和小孢子细胞（来源于小孢子的又称花 粉胚），经离体培养而形成的类胚结构。染色体为单 套，可发育成单倍体植株，经染色体加倍后才能形成可 育的植物体。,(3) 胚状体的特点,两极性：胚状体在其发育的最早阶段就具有根端(胚根)和茎端。 胚状体与培养的供体外植体的维管组织无直接联系。,石龙芮下胚轴胚状体的发生 A、培养一个月的幼苗，下胚轴上产生许多胚状体；B、下胚轴部分放大；C、两个表皮细胞；DG 原胚发生过程；J、心形胚状体；H、I 已分化子叶、胚根及原维管束的胚状体。,胡萝卜胚状体与合子胚发生过程的比较 A、合子胚；B、胚状体,23 培养基组成对细胞全能性表
10、达的影响,一、培养基的营养组成 （一）无机盐混合物: 1、大量元素: N、P、K、Ca、Mg、S 硝酸盐: KNO3、NH4NO3、NaNO3、Ca(NO3)2 其中钾盐不低于25 mmol/L 。 铵盐: NH4NO3、NH4H2P04、(NH4)2S04 Ca、Mg、S 离子浓度约在13 mmol/L 之间。,其中铵盐量不超过8 mmol/L。 但单细胞培养 对氮源的要求相对较高，二者量可上升到60 mmol/L ；无机氮素(硝态氮和铵态氮)浓度过 高时，对细胞分裂很不利，二者比例是应用中值 得特别重视的问题。,2、微量元素： Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo、Cl、Co、I （在土壤和有
11、机体中含量仅“几/10万几/万”） 3、无机盐混合物的作用： 供给培养细胞无机营养； 维持培养基的酸碱度：通过影响蛋白质的等 电点，使蛋白质破坏（过高或过低）； 维持培养基的渗透压。,（二）有机物类,1、 碳水化合物是培养细胞的碳源和能源 蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖 （总：10 150 g/L ）； 2、维生素类 盐酸硫胺素(VB1)：阻止愈伤组织就会褐变死亡。常用量 为0.41 mg/L 。 盐酸吡哆素(VB6)、促进根的生长，常用量为0.5mg/L。 烟酸(Vpp)：促进植物代谢和胚胎发育， 常用量为 0.5mg/L。,抗坏血酸(VC)：具有防止组织褐变，抵制多酚类物质作用。 肌醇(Myo
12、-inositol):促进细胞壁的形成，愈伤组织的增殖。一般为100mg/L。 叶酸(VBc)：参与核酸合成。 生物素(VH)：羧化酶的辅基，与糖、脂肪、蛋白质和核酸代谢有关 。,在胚胎发生中，多种氨基酸混合使用，会起到更好的 促进作用。常用的有：甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨 酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等。其中甘氨酸是基本培养基 中重要的成分。,（三）氨基酸和酰胺类物质,（四）植物激素类,1、类型： 1）生长素类: IAA、NAA 2,4-D、IBA等； 2）细胞分裂素: KT (动力精)、6-BA(BAP)、(ZT)、2ip（戊烯基腺嘌呤）； 3）赤霉素:双萜类60余种，常用赤霉酸(GA3)；
13、4）脱落酸(ABA)。,2、生物“活性”: 生长素活性: 24-D NAA IAA 细胞分裂素的活性: ZT BA KT 腺嘌呤。ZT的活性比KT高 10倍，KT的活性比腺嘌呤大3万倍。,（五）天然复合物类,1、水解蛋白类:水解酪蛋白(酪朊素的水解物)，水解乳蛋白(乳蛋白的水解物)等。 2、酿酒副产品:酵母提取物、麦芽。 3、胚乳液:椰子乳汁、玉米胚乳和其他禾本科、乳熟期的胚乳汁。 4、果汁:番茄汁、马铃薯汁、香蕉汁、橘子汁、李子汁、葡萄汁。 天然复合物对启动植物细胞脱分化和再分化是有效的。但不同植物种适宜的天然复合物种类是不同的。,二、 培养基的渗透压,1、由培养基中各种物质的总浓度决定的；
14、 2、培养细胞是通过细胞渗透压来吸取营养的； 当培养基总浓度低于培养细胞液浓度（一定范围），即 培养细胞的渗透势低于培养基渗透势时,培养的组织细胞才 可能从培养基中平衡汲取养分和水分。 3、渗透调节物质主要是糖对培养基渗透压起决定性作用。 其他如甘露醇、盐类等。 4、培养基糖浓度应根据不同植物种类和不同培养目的进 行筛选。,三、培养基的酸碱度,1、精确调试：用pH 测定计直接测定pH值，适用于单细胞和原生质体培养。 2、粗放调试：pH值试纸比色测定，方法简单、适用于器官和组织培养。 培养基pH 值用1 mol/L HCl或 KOH 进行调节。 调节的依据: 1)按照植物长期生活所适应的酸碱度来
15、调节：如长江以南地区偏酸（红壤），北方地区偏中性或微碱性。多数植物适应的pH 值范围是5.86.0，有些适应范围则宽些。,果树：苹果5.86.0 葡萄5.76.0 桃6.07.0 荔枝5.8 2)依据培养基硬度： 培养基PH升高,其硬度增加;PH降低,硬度下降； 3) 依据培养基中某些物质的稳定性： 如FeCl2 pH6.2 失效 柠檬酸铁 pH6.0 失效 EDTA-Fe pH7.0 未失效(螯合铁,能忍耐高pH,) 赤霉素: pH34时,最稳定, pH1或 pH 7.5时分解失活。,2-4 影响细胞全能性表达的因素,一、环境因素 (一) 湿度条件 1、微环境中（试管、三角瓶）相对湿度常常达
16、到100%。 2、周围环境的相对湿度低于60%时，培养基容易干涸而会改变培养基的渗透压。 3、周围环境湿度过高时，培养室潮湿，具备各种细菌和霉菌的滋生条件，造成培养基和培养材料的污染。 4、周围环境较适宜的相对湿度为70%80%。,(二) 温度条件,1、范围:1035； 最适: 28左右。 2、确定根据： 植物种类的起源和生态型 （喜温还是喜凉）；昼夜温差 。,(三) 光照条件,1、光周期的调节 三种基本方式：全暗、周期照光、散射性照光。 常用光量范围:10004000 Lx (勒克斯)，离体培养中通常难以达到4000 Lx,一般光量在20003000 Lx 。 100Lx1.9molm-2s-1（量子通量密度） 2、培养光照的确定： 依培养发育阶段：愈伤组织阶段弱，以后逐渐加强。,3、光质：,一般用白炽荧光灯（日光灯），其光谱
