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1、第三节 病毒分离及鉴定,要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： 从患病者体内分离出病毒； 在实验动物或寄主细胞中可以培养； 证明这种培养物具有滤过性； 在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； 能重新分离出病毒.,一、标本的处理,（一）除菌处理 粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4过夜。 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4作用4小时。 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4过夜除菌。,（二）研磨和稀释,对脑、脊髓等组织标本首先应经研磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液（pH7.6肉汤或10
2、脱脂牛乳生理盐水或0.5水解乳蛋白Hanks液）制成组织悬液，然后经2000转分离心20分钟。必要时可加抗生素处理（同上）。,病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。,二、病毒的分离培养,(一）动物接种法,接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。,按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜。,动物接种的优缺点：,优点：（1）不需要复杂的仪器设备； （2）技术简单； （3）易成功,缺点：（1）个体差异大 （2）价格昂贵 （3）数量有
3、限 （4）需要隔离畜舍,（二）鸡胚接种,1. 鸡卵的选择 一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致 。 2. 孵育 孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38-39，相对湿度为4070，孵育8日后，鸡卵应每天翻动12次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。,3. 检卵 鸡卵孵育45天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。 （1）未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 （2）活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。,（3）死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎
4、频死或已经死亡，应将其挑捡出来。 鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。,鸡胚羊膜腔接种：用1214天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查（图7-8）。常用于流感病毒的初次分离。,鸡胚卵黄囊接种：用58天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄囊膜检查（图7-7）。常用于某些嗜神经病毒的分离。,4.接种,绒毛尿囊膜接种：用10l 2天鸡胚，以无菌手续在蛋壳上开小窗，然后将材料滴在绒毛尿囊膜上孵育后。观察膜上有无斑点病变(图7-10)。常用于培养单纯疱疹病毒、天花病毒和痘病毒。,尿囊腔接种 用912天鸡胚，将标本接种于尿囊腔, 孵育后取尿囊液检查(图7-9), 常
5、用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等。,5.剖检及收获,收获前鸡胚应置4冰箱过夜，使鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。,鸡胚接种的优缺点：,优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大、不需特殊设备 。,缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。,(三）细胞培养,根据细胞的类型和培养细胞代数的不同，可将其分为两种。,细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养。,原
6、代细胞培养 即从机体内取出细胞置试管或瓶内生长成单层细胞后，立即接种病毒，可用于产生病毒疫苗.这种原代细胞为二倍体细胞，不能保存和传代,故而不便用于诊断。常用的有鸡胚、猪肾和地鼠肾原代细胞。 传代细胞 它是由二倍体细胞或癌细胞突变制成的,染色体数为非整倍体,细胞随时可以获得,生长迅速,可无限传代.,细胞培养的方法,静置培养：实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。 旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。,组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病变后，就可取培养液或培养液与细胞培养物混和
7、物，细胞培养物中的病毒可采用冻融、超声波等方法使其释放出来。,病毒的获得,优点： 每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等； 无个体差异，准确性和重复性好； 可严格执行无菌操作； 细胞培养本身就能显示病毒的生长特征； 应用空斑技术可进行病毒的克隆化。,三、病毒鉴定,1. 形态学鉴定,细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）,病毒在细胞内增殖后，可引起细胞的不同变化。常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或脱落，这些改变称为细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。,CPE出现的时间也是鉴定病毒的标志之一。,细胞病变,正常细胞,细胞折光性，变圆，局部全层，死
8、亡脱落，如：肠道病毒,细胞聚集成丛，似葡萄串状，细胞间常有细丝状间桥连接，细胞变圆或膨大，如：腺病毒。,细胞融合现象,病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞。,细胞融合现象,包涵体,定义：是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，称为包涵体。,包涵体的性质,病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的Negri氏体； 大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体； 细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体。,胞浆内有空泡形成，如：猴病毒SV40
9、、呼肠孤病毒等。,感染细胞具有吸附红细胞的能力 感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用,2. 血吸附和血凝作用,多见于以出芽方式释放的病毒。,红细胞吸附,正常细胞,（1）血吸附作用,吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定具有吸附特性的病毒。,（2）血凝作用,血凝试验,血凝抑制试验,有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合.,四、 电子显微镜检查,病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组
10、织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。,透射电子显微镜,1. 正染法：超薄切片法,鸡痘病毒（超薄切片）,超薄切片法的优缺点：,优点：可观察病毒形态和形态发生过程 缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存,2.负染技术,负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。,滤纸,1-2分钟后电镜观察,口蹄疫病毒的电镜负染,负染法的优缺点：,优点：快速简易（10-20min）；分辨率高；图象清晰地病毒结构 缺点：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有样品应处于悬浮状态,免疫电镜技术是将抗原抗体反应
11、的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。,3.免疫电镜技术(Immune electron microscopy，IEM),（1）免疫凝集电镜技术,抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏感性，确定病毒的血清学性质。,（2）免疫电镜定位技术,特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。,酶标记染色,五、 血清学试验,是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用ELISA、琼脂扩散、中和试验、
12、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗原。,virus,1.中和反应,观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。,2.补体结合反应,溶血 （-）,不溶血 （+）,3.免疫扩散,4.酶联免疫吸附试验 （ELISA）,将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。,（1）间接ELISA,（2）夹心ELISA,六、分子生物学技术,聚合酶链反应 （PCR）,2. 核酸杂交技术,核酸探针（probe）是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，可检测待检样品中特定的基因顺序。,思考题,细菌分离培养的方法有哪些？ 如何进行细菌鉴定？有哪些方法？ 何为细胞培养？常用细胞有哪几种？ 对病毒进行细胞培养有哪些种类？ 如何对病毒进行鉴定？,
