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1、（并购重组）内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中重组表达载体的构建四川内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中重组表达载体的构建生物科学2003级廖俊华指导教师陈惠教授摘要：以生物化学与分子生物学实验室克隆并测序的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因（Genbank登录号：DQ782954）为模板，通过PCR将编码信号肽的序列去除，然后与pMD18-TVector克隆载体连接，构建pMD18-TVector亚克隆载体。对pMD18-TVector质粒先进行Bgl单酶切，回收后再进行Sph单酶切，通过两次单酶切胶回收内切葡聚糖酶基因（不含信号肽），并构建巨大芽孢杆菌重组表达载体pHEC-End，将重组表达载
2、体转化到大肠杆菌DH5中。通过对转化子进行菌落PCR和质粒的酶切检测证明成功构建了内切葡聚糖酶的巨大芽孢杆菌表达载体。关键词：巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，内切葡聚糖酶，重组表达载体ConstructionofeukaryoticExpressionVectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumLIAOJun-huaBiologicalScience,Grade2003DirectedbyChenHui(Prof)Abstract:BythewayofPCR,thesequencecomingfromendoglucanasegene(Gen
3、bankNo.DQ782954)inB.subtilisC-36strainandcodingforthesignalpeptideofendoglucanasewasremoved.TheendoglucanasegenewasclonedandsequencedintheLaboratoryofBiochemistryandMolecularBiology.ThenthegenewithoutthesignalpeptidesequencewasligatedwiththecloneplasmidpMD18-T.ThepMD18-TVectorwasconstructed.First,th
4、epasmidwascutedbyBgl.Then,thepasmidwascutedbySph.Bydoubleenzyme-cut,thegeneofendoglucanaseinB.subtilisC-36strainwithoutsignalpeptidewasrecived.TheeukaryoticexpressionvectorpHEC-Endwasconstructed.Eventually,theeukaryoticexpressionvectorwastransformedintocompetentE.coliDH5.BythewayofcolonyPCRandrestri
5、ctionenzymedigestinganalysis,theeukaryoticexpressionvectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumwasconstructedsuccesfully.Keywords:BacillusMegaterium，Bacillussubtilis，endoglucanase，eukaryoticexpressionvector纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶三大类1。纤维素被它降解后可转化为人类
6、急需的能源、食物、化工原料，对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义2。随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值3。纤维素酶成本高以及酶活力低已成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此，构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。几乎所有已克隆到的纤维素酶基因都在大肠杆菌中得到了表达，但是都几乎存在着表达量低、分离提纯困难的缺陷。而芽孢杆菌因具有独特的蛋白分泌系统，使得在表达外源蛋白的宿主菌中深受青睐。其中枯草芽孢杆菌是应用较广泛的一种外源蛋白表达系统，并且已用于商业化生产
7、酶制剂，例如，Genecor厂家就以该菌作为生产碱性蛋白酶的工程菌4。近年来，巨大芽孢杆菌也在这方面显示出了较好的应用前景，与枯草芽孢杆菌相比，巨大芽孢杆菌还具有两大优点：首先是它不具有碱性蛋白酶，从而使外源蛋白能很好的表达而不被降解；再次是重组质粒能够在宿主菌中稳定存在5。有很多蛋白已经成功地在巨大芽孢杆菌中得到过量表达，如：Rygus和Hillen6（1991）在巨大芽孢杆菌中成功地表达了四种外源蛋白基因，在木糖操作子的调控下，这些基因的表达提高130到350倍不等，且未发现蛋白酶水解情况。目前还未见有关在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道，四川农业大学生物化学实验室通过自行筛选得到一株
8、产内切葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌并克隆到了编码该酶的基因（GenbankNo.DQ782954），拟在此基础上构建该基因的巨大芽孢杆菌表达载体，实现该基因在巨大芽孢杆菌中的分泌表达。本实验将不含信号肽枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因与巨大芽孢杆菌表达载体pHIS1525进行连接，构建重组表达载体，使之能在表达载体自身信号肽的引导下进行融合表达，为进一步研究枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的高效表达及基因工程菌投入生产奠定基础。1材料与方法1.1菌株及载体：本工作所使用的菌株和质粒见表1。表1实验所用的菌株及质粒Tab1Thestrainandplasmidusedinthe
9、experimentstrain/plasmidCharacteristicssourceJM109recA1supE44endA1hsdR17gyrA96relA1thi(lac-proAB)FStoredinthislabDH5supE44lacU169(80lacZM15)recA1StoredinthislabpMD18-TVectorAmprlacZTaKaRaBiotechnologypHIS1525TetrAmprxylRPxylAMoBiTecB3plasmidpMD18-TVectorincludingtheendoglucanasegeneConstructedinthis
10、lab1.2分子生物学试剂：引物由上海英俊生物技术有限公司合成；BglII、SphI、重组TaqDNAPolymerase、dNTP、T4DNALigase、pMD18-TVector购自TaKaRaBiotechnology；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNAMarkerIII、DNAMarkerVII、DNA/HindIII购自天为时代；氨苄青霉素购自上海生工。1.3主要药品NaCl、胰蛋白胨、酵母浸出粉、琼脂粉、琼脂糖、0.1mol/LCaCl2、甘油（终浓度为30%）。1.4主要仪器：电热恒温培养箱、HZQ-F全温振荡培养箱、酸碱pH计、TGL-16G台式普通离心机、板式电泳槽、电
11、热恒温水浴锅、PCR仪、凝胶成像仪等。1.5培养基、抗生素贮存液及琼脂糖电泳缓冲液：LB培养基：1%胰蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母浸出粉，pH7.0（用1mol/L的NaOH调PH值）；配制固体培养基时需加入1.5%-2.0%的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入氨苄青霉素（终浓度为100g/mL）。氨苄青霉素（Amp）贮存液7：100g/mL（溶于双蒸水中），过滤除菌，小份分装（1mL/份）后，-20保存。琼脂糖电泳缓冲液8：5TBE贮存液：54gTris碱，27.5g硼酸，20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），溶于1L去离子水，用时稀释10倍。0.5mol/LEDTA（pH8.
12、0）：将186.1g二水乙二胺四乙酸（EDTA-Na.2H2O）加入800mL水中，用磁力搅拌器剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8.0，定容至1L。0.7%的琼脂糖凝胶：称取0.7g琼脂糖于100mL0.5TBE中，用微波炉加热置溶液澄清为止，然后加入5L的GoldView核酸染料，混匀即可用。1.6方法.1.6.1引物的设计：根据已经克隆并测序的内切葡聚糖酶基因（Genbank登录号：DQ782954），结合信号肽预测结果，应用Primerpremier5.0软件设计一对引物，使其通过PCR去掉该基因自身信号肽编码序列，同时加入适当的酶切位点（BglII、SphI），使其能够通过连接将该基因置
13、于表达载体信号肽编码序列之后（表达载体pHIS1525的多克隆位点序列如图1），且保证正确的阅读框。已经预测的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶蛋白序列信号肽切割位点在29位和30位氨基酸残基之间，成熟蛋白为470氨基酸多肽，因此设计引物如下：上游引物（P1）：5AGATCTCAGCAGAGACAAAAACGCCAGT3下游引物（P2）：5GCATGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAA3下划线是引入的酶切位点，分别是Bgl、Sph；A是为了不改变阅读框而引入的碱基。图1pHIS1525的多克隆位点序列Fig1Sequenceofthemultiplecloningsites(MCS)o
14、fpHIS15251.6.2目的基因的获得：1.6.2.1B3质粒的提取及其PCR接种一环B3菌株于10mLLB液体培养基中，37200r/min培养过夜，用质粒提取试剂盒按操作说明提取B3质粒9。以提取的B3质粒为模板根据设计合成的引物进行PCR10，通过PCR获得目的基因，其反应体系如表2：表2PCR反应体系Table2CompositionofPCR试剂名称用量ddH2O32.5L10PCRbuffer5.0L25mmol/LMgCl22.0LP11.0LP21.0LdNTPmixture6.0L模板DNA2.0LTaq聚合酶0.5LTotalvolume50.0L按上述顺序加入各组分后
15、混合均匀，PCR反应参数为：94预变性2min，94变性1min，65退火1min，72延伸90s，30个循环后，72再延伸10min，4保存。反应结束后取3LPCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。1.6.2.2PCR产物的纯化由于克隆需要的DNA片段需要较高的纯度，PCR产物需经过琼脂糖凝胶电泳充分分离后，利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒从凝胶中回收目的DNA片段11。1.6.3目的基因的克隆:1.6.3.1大肠杆菌JM109（或DH5）感受态细胞的制备：参照分子克隆试验指南（第三版），采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，具体方法如下： 挑取一环E.coliJM109（或DH5）菌株在LB平板上划线37培养后，挑取单菌落转到10mLLB液体培养基中，37200r/min培养过夜； 将上述培养液按2%接种量接种到50mLLB液体培养基中37200r/min振荡培养2-3小时； 将培养后的菌液置冰浴中10min后转移到无菌的50mL离心管中，44000r/min离心10min，去掉上清液，将管倒置1min使痕量培养液流尽； 向管中
