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1、（VR虚拟现实）食品SEMINAR论文蛋白质与脂肪酸间结合检测方法及研究进展食品学院B09107258刘贺摘要：蛋白质与脂肪酸间作用方式已用多种方法进行过实验。除传统方法外，近年来在油脂界应用较多的结构X-衍射和NMR方法也为这个领域带来了巨大变化。本文综述了迄今为止常用的研究脂肪酸与蛋白质结合的方法并对一些最新进展进行了分析。关键词：脂肪酸蛋白质FABPsAbstract:Theinteractionsoffattyacidswithproteinshavebeenstudiedbyavarietyofconventionalapproachesfordecades.Inadditionto
2、traditionalmethods,theapplicationoftechniquesofstructuralbiologysuchasX-raycrystalandNMRhasbroughtaboutdramaticadvancesinthisimportantareaoflipidresearch.Keywords:fattyacid;protein;fattyacid-bindingproteins数十年以来脂肪酸与蛋白质间作用力均用各种传统方法进行研究，且所得到的有效信息较少。近些年来，结构生物学方法如X-衍射和NMR法的应用对这一领域的油脂研究带来了巨大变化。几种蛋白质的高分辨率
3、的X-衍射和NMR图谱揭示了蛋白质的完整三级结构以及其与脂肪酸的相互作用方式。本文对目前常用的FABP检测方法如免疫检测法、X-衍射法、核磁共振(NMR)法及传统分析方法等及其研究进展进行了综述。文中所总结的结合脂肪酸的蛋白质有常见的人血清白蛋白和脂肪酸结合蛋白。迄今为止已有至少17种脂肪结合蛋白被明确鉴定1，而其中至少10种都属于脂肪酸结合蛋白(FABP)2。FABP是一族分子量为1416kD的蛋白质，至少有9种类型：肝、小肠、心、脑、肾、骨骼肌、脂肪组织、回肠、表皮等，通过亲和层析的方法可以从以上不同组织细胞获得相应的纯品。这一族蛋白还包括细胞视黄醇结合蛋白和。FABP在体内的含量丰富，占
4、细胞内可溶性蛋白总量的38%。所有FABP的氨基酸系列有3870%的等同性3。组织损伤后，细胞蛋白质会从血浆中释放出来，对于局部缺血、再灌注、神经紊乱、癌症或器官排异等引起的组织损伤，FABP可作为一种可靠的生物标志蛋白。不同亚型的FABP在评价脑损伤、骨骼肌损伤、肾脏损伤、肝脏损伤等的应用是最近研究的热点，因此检测FABP，并了解脂肪酸与FABP间作用方式及作用特点具有重要的价值4。1免疫检测法有关FABP定量检测的最早报道是Ockner等1974年在研究I-FABP时采用的放射免疫法5。在此测定方法中，Ockner等首先通过凝胶过滤柱层析及等电聚焦电泳获得纯化的I-FABP，然后用纯化I-
5、FABP免疫家兔以获得I-FABP抗血清并用14C进行放射性标记。14C标记抗血清与特测标本反应后，通过测定免疫沉淀中放射性比活度来植测相应I-FABP的浓度。Ockner等报道的方法准备过程及测定过程都较为繁琐，价格昂贵且存在放射性污染，但为FABP测定方法的改进奠定了基础。1997年，Wodzig等6成功地开发了检测H-FABP的一步夹心ELISA法，与两步ELISA法的灵敏性和特异性基本相同。2004年，Pelsers等人7利用亲和纯化重组人源化的抗B-HABP多克隆抗体开发了B-FABP检测的夹心ELISA法。ELISA法是FABP定量测定的一个标准的方法。2X-衍射法许多研究者用不同
6、方式来研究脂肪酸与白蛋白间作用方式8。1980年，Brown根据氨基酸序列以及二硫键位置，并且考虑了当时的生物物理及生物化学研究，从而提出了白蛋白的具体三级结构9。这个模型虽然较为美观但是推测性太大，在以X-衍射研究脂肪酸与白蛋白间作用出现以前，大量的研究结果只得到一张关于白蛋白与脂肪酸作用的低分辨率的图片。蛋白化学家与油脂学家都急切想了解白蛋白的具体三级结构。为达到此目标，实验中遇到了许多阻碍，其中包括膜衍生白蛋白，即异源纯化及结晶均难度较大。1994年，X-衍射用于研究从人体血清纯化出的白蛋白结晶10，后来又将其应用于重组体蛋白质，从而第一次提供了这种重要蛋白质的精确图片。这张高分辨率的结
7、构展示出这种蛋白质总体呈心形而不是这位作者之前所说的“圆柱形”11。其他研究者也随后以X-衍射研究了心形的脱脂蛋白质和与脂肪酸结合后的蛋白质(图1A)。脱脂蛋白质有一个复杂的结晶结构；它没有Brown所说的较简单且有三个圆柱的对称结构，脂肪酸如何结合进这种结构也没有任何证据。目前最完整且分辨率较高的脂肪酸-白蛋白结合图是用X-衍射法得到的人血清白蛋白(HSA)和特异脂肪酸共结晶所得到的12。HSA与8分子肉豆蔻酸(C14:0)(图1B)揭示了蛋白质的主要结构要素以及脂肪酸-蛋白质相互作用结构。蛋白质由三个域组成，而每个域又由两个亚域组成。主要结构是螺旋结构，每个域中有10个螺旋结构，而亚域中有
8、4或6个。8个脂肪酸贯穿于整个蛋白质结构中，且结合特点为：脂肪酸的羧基与侧链中碱性及极性氨基酸形成盐键或氢键，而脂肪酸链则嵌入螺旋结构的疏水区域中。脂肪酸的羧基处于水相中，当通过疏水通道时，长链脂肪酸几个结合位点的甲基也暴露在水相。不含脂肪算的HSA结构(图1A)和C14:0/HSA复合物(图1B)表现出明显的构象变化。总体构象的巨大改变或许是结合多个配基后产生的后果，而这种现象在其他蛋白质中未发现。另外，体外这种由配基引起的白蛋白构象变化是否会影响脂肪酸向细胞内的运输仍是一个值得探讨的问题。图1X-衍射图谱(A)脱脂HSA的主要结构(B)8个豆蔻酸配基的不同结合位点分布显然，HSA的X-衍射
9、结构代表了白蛋白研究的一个重大进步，尤其在脂肪酸与其作用的研究方面。然而，X-衍射本身的局限性以及所得到的各种类型的信息为以其他科技手段继续进行研究留下了空间。对结晶结构最理想的补充就是溶液结构，这样除了可以揭示复杂的三级结构外也可揭示蛋白质的具体动力学特性。3核磁共振(NMR)法FABP的早期研究发现，FABP是高度水溶的，它的配基通常是脂肪酸，中性条件下一般不溶于水，而FABP族中有一些种类还会结合诸如胆汁酸之类的油脂13。它的生物学研究包括与脂肪酸的结合特点是用13CNMR法进行研究的。一些NMR的分析得出结论：鼠肠道(I-)FABP仅结合一个脂肪酸，且脂肪酸的羧基与精氨酸残基相互作用1
10、4，这种预测随后被其具体三维结构所证实。FABP通常较容易纯化和结晶从而用于X-衍射分析，此外，其低分子量及较少的螺旋结构含量也使得它可用NMR进行结构研究。第一个被报道的FABP结构是鼠I-FABP的结晶结构15。X-衍射的结构与人I-FABP的NMR结构相似程度较高。一篇文章报道了11张NMR溶液结构图和28张FABP结晶结构图，均为高分辨率图，发现即使氨基酸序列同源性较低，甚至低于25%，但是所有FABP族成员均有相似的结构骨架，而这与血白蛋白完全不同。FABPs相同的重要结构特征可以用人I-FABP溶液结构来揭示(图2)。FABPs的-折叠结构含量较高，基本不含螺旋结构，只有少数例外，
11、且不含二硫键(disulfidelinkages)。NMR所得FABP结构与X-衍射所得结构一样精确，但NMR还可揭示蛋白质的动力学或构象学变化。例如，图2A中所展示的10个能量最小化结构说明了蛋白质终端和螺旋区域仍有很大的变化性。一些辅助的NMR实验，例如蛋白质骨架的弛豫时间测定可以揭示蛋白质各部分的动力学特性，并对配基如何进入和脱离蛋白质提供线索16。I-FABP的带型图展示了10条逆平行的-strands形成了“上-下”型-barrel。-barrel内部空间较大(8503)其中的疏水和极性/带电残基数量基本相同。图2核磁共振(NMR)谱图(A)DIANA计算出的骨架结构(B)模拟退火及
12、能量最小化后计算所得彩带谱图4传统分析方法17虽然有许多方法应用于检测FA和FABPs间作用，但目前为止，一些传统的方法如Lipidex，ADIFAB法和ITC法还是应用最广泛的手段。4.1Lipidex法(TheLipidexassay)这种方法是由Glatz和Veerkamp所发展起来的，包括用hydroxyalkoxypropyl衍生化处理过的疏水性Sephadex-G25(Lipidex1000)在0下分离未结合FA。此方法中，脱脂FABP在放射标记的FA缓冲液中平衡，然后加入Lipidex与未结合FA进行反应，将Lipidex/FA复合物离心除去，测定表面放射性即可知FABP上FA的
13、结合量。Dissociation常数是用Scatchardplot所计算的，同时可得到总蛋白浓度以及未结合与结合FA的比率。这种方法的问题之一是结合到Lipidex或FABP上面的FA分离过程较为缓慢，这是由于FA需要从后者转移到前者上面去。因此，结合到FABP上面的脂肪酸量就变得过低；而0下分离也导致结果不可信，因为dissociation常数是随温度进行变化的。因为这种方法并不是真正在平衡条件下进行，Kd值通常被认为偏高，这种方法能够根据FABP或其配基类型得到长链脂肪酸在mM级的亲和度。但是这种方法可应用于低溶解度配基。4.2ADIFAB法(Acrylodanlabeledintesti
14、nalfattyacidbindingproteinassay)这种方法的出现避免了Lipidex方法的一些缺陷。它是一种荧光方法，将小鼠肠FABP中-螺旋的Lys27用荧光acrylodal进行标记，然后利用这种FABP通过荧光变化测定水溶液中未结合的游离FA。ADIFAB是一种测量水溶液中未结合游离脂肪酸的专利方法，较简单，且一步即可完成。它不仅能提供结合常数，还能得到热动力学参数及结合kinetics。如果没有未结合游离脂肪酸，ADIFAB的探针荧光在432nm，激发波长为386nm。当游离脂肪酸存在时，发射波长发生蓝移，505nm处峰随脂肪酸结合浓度相关。505nm处和432nm处荧光
15、强度之比可以准确表示脂肪酸结合能力。4.3等温滴定热量法(isothermaltitrationcalorimetry)此方法是由Miller和Cistola首先应用的，可测定FABP与脂肪酸间热量。将脂肪酸滴定到含FABP的溶液中，为了维持样品温度所需热量即为实验的原数据。分析每次加入脂肪酸时所得到的峰值，这些峰值对应热量的吸收与释放，也代表了表观结合焓。不过此方法需要价格昂贵的微型滴定热量计和较大的蛋白质计量器(quantities)。4.4高效亲和层析(high-performanceaffinitychromatography)将固定蛋白质应用与色谱体系中研究生物分子间作用被称为“生物
16、色谱”或高效亲和色谱(HPAC)，这种方法可以同时定性定量测定可逆的水溶性蛋白结合情况。HPAC利用了一种生物聚合体以共价或非共价的形式结合到高效液相色谱上，同时应用了高效液相色谱的实验技术。这种技术中，目标蛋白固定在液相支柱上，而从固定相上得到的色谱保留时间情况即可反应游离蛋白的结合特性。一旦一种已知化合物已由色谱保留时间所确定，这种化合物即可作为确定另一种化合物结合能力的标准物。这种方法非常灵敏、快速且精确。但生物体系的极端复杂性限制了合理设计一个能够直接模仿给定生物体系的色谱体系。另外，色谱学是一种能够提供许多精确、可重复数据的方法。用这种方法，通过对几种蛋白质的研究即可了解结合特点。Massolini将鸡肝FABP结合到氨丙基硅胶上作为固相，检测蛋白的对应选择性，而为了揭示FA的保留机制，他还进行了竞争性实验：以其它脂
