细胞培养的设备和操作技术教学案例

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1、细胞培养的设备和操作技术,第二章,主讲内容,实验室的设计和基本操作技术 培养基及其配制,第一部分 实验室的设计,细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即： 实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌）； 无菌操作； 控制培养。,1、基本实验室： 准备室 接种室 培养室, 作用 植物细胞和组织培养所需器具的洗涤、干燥和保存；培养基的配制、分装和灭菌；化学试剂的配制；重蒸馏水的生产等。 设计要求 面积20m2左右。通风透光，地面防滑，墙面防潮。,准备室, 实验台架 大、小水槽 烘箱 冰箱 天平系列 pH计 高压消毒锅 各种玻璃器皿 药品柜 （磁力）搅拌器 电炉 蒸馏水器, 设 备,其中：玻璃器皿包括三角瓶

2、、试管、培养瓶、培养皿、烧杯、量筒、移液管等 移液枪（根据条件需要）由枪和枪头组成 其他：锅、微波炉等,磁力搅拌器,电子天平,万分之一,百分之一,pH计,微量移液器,蒸馏水器,接种室 也叫无菌操作室 无菌操作室并非无菌，但应该保持清洁 作用 供外植体的接种，培养物的转移和原生质体的游离培养操作之用。, 设计要求 墙壁光滑平整，地面平坦无缝，除出入口和通气口外，应当密闭，空气不能对流，或者空气经净化后进入室内。 无菌室旁边应设有缓冲间，缓冲间内应有紫外灯，随时可进行灭菌。,无菌室内的日常灭菌：定期用甲醛和高锰酸钾混合后熏蒸，产生大量蒸汽，杀灭微生物。 使用前处理：用新洁尔灭（1：50）擦净，然后

3、用紫外灯照射灭菌至少20分钟，操作前用70%酒精喷雾。,思考：紫外灯如何杀菌？操作中要注意什么？, 设 备, 紫外光灯 空调 放物架（或医用小平车：推送、放置培养基用；） 无菌操作用的器具：酒精灯、70%酒精消毒棉、解剖刀、弓背镊子、解剖针、剪刀等。, 超净工作台： 内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等 每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。,其它部件： 离心机：分离原生质体用； 点融合仪：细胞融合用。,离体组织和试管苗生长发育的场所， 应为培养物创造适宜的温、光、气等条件。 设计要求 培养室内要求内壁保温、光滑

4、、室顶高2.6m左右，易于控制温、湿度，窗上要求装双层密封玻璃窗，室内有足够电源。, 作用, 设 备, 空调机：冷暖型 加热器 定时装置：控制光照时间 培养架：放置培养瓶 摇床和转床：悬浮培养 各种光质灯管：光照培养 温度计：控制温度 遮光帘：供暗培养之用,2、辅助实验室： 细胞学实验室 摄影室及暗室 生化分析室,细胞学实验室, 主要设备 各种显微镜，显微照相设备，切片、制片仪器设备，染色用具，暗房设备等。, 作 用,植物组织和细胞培养过程中，需随时观察记录其细胞学和形态解剖学的变化，故要设置细胞显微观察室。,细胞工程实验室基本设备配制小结,基本设备：冰箱、天平、酸度计 灭菌设备：蒸汽压力灭菌

5、锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 无菌操作设备：净化工作台、接种箱, 光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜,第二部分 基本操作技术,基本操作技术主要是围绕无菌操作技术展开的一系列操作技能，内容主要包括： 一洗涤技术 二灭菌、消毒技术 三、接种技术,一、 洗涤技术,、洗涤目的：去除杂物，降低带菌量 、根据洗涤对象的不同，主要分为：,器皿洗涤（包括玻璃、塑料、搪瓷、 不锈钢器皿）,培养材料洗涤,（一）器皿洗涤,根据洗涤对象的具体情况可分

6、为以下三种：,特殊洗涤,微生物大量污染的洗涤,常规洗涤, 常规洗涤, 自来水洗去油渍、霉菌等脏物； 温肥皂水中浸泡一定时间后用刷子刷净； 自来水冲洗干净，至瓶壁不挂水珠为止； 蒸馏水淋洗内外壁 将玻璃器皿倒置：晾干或烘干（5075） 放入除尘柜中备用, 微生物大量污染的洗涤 微生物污染器皿加压灭菌后再洗涤,特殊洗涤（如沾有蛋白质类物质或其它有机物时) 经过常规洗涤未过蒸馏水的器具，浸泡入洗液（铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成）中数分至数小时； 回收洗液，器具先用自来水洗净，蒸馏水淋洗，烘干（75）,（二）、试验材料的清洗 清洗目的：来自自然界的试验材料，包括

7、来自土壤中的幼茎、磷茎，滋生着各种微生物，尤其是细菌的芽孢和真菌的孢子，一旦与培养基接触，就会很快的繁殖起来，造成培养基和培养材料的污染。 清洗方法：先用自来水冲洗5分钟，然后用中性洗涤剂清洗，注意勿损伤试验材料。再用自来水流水冲洗半小时，用于下一步的药剂灭菌。,二、灭菌、消毒技术,（一）关于有菌和无菌的概念 有菌的范畴：,凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。,高压高温处理（工具、器皿、培养基等） 物理或化学处理； 火烤后的物体； 健康的动植物不与内外部表面接触的组织 内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但 不会影响培养，也不会污染）

8、,无菌的范畴：,（二）灭菌、消毒技术作用和意义 植物组培中，凡用于培养和无菌操作的房间、器具、培养瓶、培养基，培养材料和操作者的衣物和手都应随时进行灭菌，以确保不受杂菌污染，否则，由于杂菌的生长繁殖速度一般都比培养的组织快得多，最终将把组织全部杀死，这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒的代谢废物，因此在培养容器内部保持一个完全无菌的环境是绝对必须的。,（三）灭菌、消毒种类,物理方法： 物理灭菌：高温高压灭菌（干热/湿热）、烘烤或灼烧灭菌、射线处理、超声波等 物理除菌：过滤（0.1微米、0.22微米、0.45微米、0.8微米等） 、离心沉淀等； 化学方法：使用灭菌剂，如薰蒸灭菌、消毒液灭菌（酒

9、精、升汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、过氧化氢）, 消毒、灭菌的对象： 接种室 材料（外植体）： 完全杀死材料表面的微生物过程： 洗洁精酒精氯化汞等 器皿用具消毒（灭菌） 培养基,（三）、培养基、器具的灭菌 用灭菌锅灭菌：一般121，灭菌20分钟。自动锅：加足水后，调好时间、温度、即可自动运转。 手动锅:加足水后，关好，通电。待压力升到0.5kgc时，打开排气阀排除锅内的冷空气。然后关闭排气阀，升至1.1kg c(121 左右)时计时，用通电、断电来保持20分钟。待降至压力为0时取出。 器具的灭菌：也可用烘箱160 ，90120分钟,（四）、过滤除菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如

10、果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些激素GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌或者两者结合。另外酶等也需要过滤灭菌； 灭菌方法：将激素或酶配成一定浓度，用注射器过虑，0.20.25微米。配制培养基时，先将培养基高压灭菌，待温度降至50左右时，加入适量的已过虑除菌的激素等，然后分装。,（五）、外植体的选择与消毒：,1、外植体的选择 选择优良的基因型：蔬菜等作物、花卉等观赏植 物等的脱毒快繁选优良种。 取材：从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取 材。母株代谢旺盛期取的外植体再生能力强， 试验容易成功。 外植体大小选择：如利用茎尖培养，脱毒快繁， 茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养， 胚龄也非常

11、重要。 选择外植体的时期,2、外植体的消毒：,取材 将老的组织去掉 自来水冲洗 洗衣粉水洗（简单杀菌） 自来水冲洗 70酒精处理 消毒剂处理 灭菌蒸馏水冲洗35遍。,消毒时间，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，较老的材料相对杀菌时间较长，反之，较短。一般杀菌，酒精10秒，升汞512分钟。,外植体在接种之前，须经严格的灭菌，同时又要注意不损伤外植体。不同灭菌药剂杀菌力不同，故在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间，对不同植物种类的不同外植体，处理也有不同。 另外，外植体在进入消毒剂之前，应认真取材及清洗，尽可能地减少其带菌量。,外植体除菌注意事项：,消毒剂 使用浓度() 消毒时间(分)

12、效果 残液去除难易 次氯酸钙 10 530 好 易 次氯酸钠 25 530 好 易 新洁尔灭 1020 530 好 易 氯化汞 0.11 210 最好 最难 过氧化氢 1012 515 较好 最易 抗菌素 450mg/L 3060 较好 较难,几种常用消毒剂的效果比较,附：常用消毒剂的性质,7075酒精： 具有较强的穿透力和杀菌力，常作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和灭菌的双重作用，但不能彻底灭菌，必须结合其他药剂灭菌。一般处理时间为530s。为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1的酸或碱，因为H+和OH-可改变细胞膜带电荷的性质而使透性增加，提高杀菌的效果,升汞（HgCl2）： 剧

13、毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg2与带负电荷的蛋白质结合，使菌体酶蛋白变性失活。使用浓度0.10.2，一般浸泡处理612min就可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌，灭菌效果极好。但用升汞灭菌的外植体材料须用无菌水反复多次冲洗，才能洗去残留的汞，否则会对外植体产生毒害作用。通常用无菌水冲洗不得少于5次。由于升汞的毒性剧烈，使用中务必注意安全。,升汞废物的处理,升汞为剧毒药品，一则使用时注意别溅到皮肤上；二则使用后要进行处理，不能直接倒入下水道。,升汞处理方法：,升汞Na2S,絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）,FeSO4（中和过多的Na2S ）,次氯酸钠（NaClO）： 用市售的“安替

14、福民”配制210的NaClO，灭菌时间530min，无菌水冲洗45次。由于它分解出具杀菌作用的氯气，灭菌处理后易于除去，无残留，既有较强的杀菌力，又对植物无害，是常用的杀菌剂。,过氧化氢（双氧水）： 常用612的溶液处理外植体材料，灭菌效果较好，由于该药剂在外植体表面容易除去，又不会损伤外植体，通常用于叶片材料的灭菌。,新洁尔灭： 一种广谱的表面活性灭菌剂，它对绝大多数植物外植体伤害很小，灭菌效果很好。通常使用1：200稀释液，处理30min或更长。,在用上述药剂进行材料的灭菌处理时，为了使杀菌剂湿润整个组织，有时还需在药液中加入润湿剂。如加入数滴或0.1的吐温（Tween）80或吐温20，或

15、者用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂充分接触外植体，以利于彻底灭菌。,三、接种技术,1所有的消毒、接种等无菌操作技术均需在无菌室的超净工作台上进行。 1、超净工作台： 内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等，每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。 2、无菌操作用的器具：刀、镊子、剪刀、酒精灯等事先已灭菌，使用中避免交叉污染； 3、操作人员在操作之前洗手、换工作服、双手消毒再操作。,培养条件 光照:光照强度、光质、光照时间 温度 湿度 pH值：5.56.5 渗透压 通气条件,根据离体培养的营养需求，培养基至少包括： 无机盐； 有机化合物； 生长调节剂,三、 培养基及其配制,培养基的基本成分,Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B,1 无机营养物质,、大量元素：,C、H、O,N、P、K、Ca、Mg、S、(Na),、微量元素：,无机盐的作用：, 一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； 二是构成一些特殊的