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1、植物保物研究方法论文题 目：现代技术在植物病理学中的应用学院(系)：植物保护学院专业年级：植物病理学学生姓名：杜友伟学 号：2016050129CRISPR/cas基因编辑系统在植物病理学中的应用摘要：基因组定点编辑是利用人工核酸酶，对复杂生物基因组特定位点快速而精确地进行遗传改造的一项新技术。尤其是最近从细菌和古细菌的获得性免疫防御反应中改造而来的CRISPR/Cas9系统，因其简单、廉价、高效以及通用的特性，目前已经广泛地应用于植物、动物、微生物等各种生物体和细胞的基因功能和应用研究中。CRISPR/Cas9系统的原理在于其携带的Cas9核酸酶RNA导向的 dsDNA结合蛋白，能够在靶位点
2、对双链DNA 进行定点切割，随后引发的非同源末端连接或者同源重组修复，导致了靶位点DNA的缺失、插入、替换甚至染色体大片段重排。关键词：基因, CRISPR, 植物病理 Abstract：The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR associated proteins(Cas9)system is a recently developed groundbreaking technology which enables the production of highly speci
3、fic genome modification with high efficiency and specificity. The CRISPR/Cas9 system is derived from the adaptive immunity system in bacteria and archaeas, it uses Cas9, a RNA-guided nuclease, to create double-strand breaks in the genomic loci of interest. The repair of breaks through either non-hom
4、ologous end joining or homonlogous recombination leads to insertions, deletions, replacements or larger chromosomal rearrangements at the desired sites of genome. The CRISPR/Cas9 system is facile, highly efficient and widely used in diverse cells and organisms, including the species that have tradit
5、ionally been a challenge in their genetic manipulations. Key words: Gene, CRISPR, Plant disease1. CRISPR/Cas基因编辑系统1.1 CRISPR/Cas基因编辑系统的发展 CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术，即一种由RNA介导的切割特异DNA片段的基因编辑系统引起了科学家们的注意。它依靠RNA引导序列与靶标DNA序列互补识别目标位点，仅需变化约20个核苷酸的序列就能靶向不同基因1-3。CRISPR/Cas基因编辑系统的发现源自于对细菌的免疫系统的研究，最早是日本科学家Nakata等4在
6、研究大肠杆菌时发现的一种特定的重复序列，但当时他们还不清楚其具体功能。后来人们发现这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中，随后科学家正式将其定义为CRISPR。2005年，多个研究团队发现CRISPR间隔序列与噬菌体或质粒等外源DNA序列高度同源5-7。2007年，Barrangou等8发现改变CRISPR中的重复序列能调节嗜热链球菌(Streptococcus Thermophilus)对噬菌体的抗性，证实CRISPR/Cas系统使细菌通过获取噬菌体DNA片段形成“记忆”，从而使细菌获得再次遭到同一噬菌体入侵时对其免疫的能力。1.2 CRISPR/Cas系统基本结构特征CRISPR/Cas系统
7、主要由CRISPR序列元件与CAS基因家族蛋白组成。CRISPR序列元件是一类独特的DNA重复序列家族，由一些高度保守的重复序列和间隔序列相间排列组成。而 CAS基因家族蛋白是CRISPR序列附近一些高度保守的相关基因编码的蛋白酶，具有核酸酶和切口酶活性，能对DNA序列进行特异剪切和修复9。随着基因组学的迅速发展，CRISPR基本结构也逐渐为人知晓。人们发现已测序的细菌基因组中约有40%包含CRISPR位点10。不同物种间CRISPR位点数目与重复序列的数目也有所不同11，但均包括4种序列（重复序列、间隔序列、Cas基因编码序列、前导序列）。CRISPR中的重复序列是一组长度约2550个碱基对
8、组成的短小回文序列，能形成发卡结构，重复次数最高可达数百次。间隔序列约为 2672个碱基对，它的位置在2个重复序列之间12。CRISPR位点一般在细胞染色体上，也有的在质粒中10。在CRISPR位点附近还存在一系列CRISPR相关基因，Cas基因编码一类高度保守的核酸相关的蛋白13。此外，在Cas基因和CRISPR位点第一个重复片段之间存在着CRISPR前导序列，该序列负责启动CRISPR 转录。图1 CRISPR基本结构Fig.1 The basic structure of CRISPR1.3 CRISPR/Cas系统工作机理CRISPR系统是细菌为了对抗噬菌体和其他病毒的侵染而进化出的一
9、套免疫系统。CRISPR系统作用大致如下：噬菌体或其他病毒入侵后，宿主CRISPR系统识别外源DNA中特定的前间隔序列和前间隔序列邻近基序。宿主将重复片段和这一段新的间隔序列整合进入CRISPR系统，插入在前导序列和原先第一个重复序列之间8, 14，形成“记忆”。加工前间隔序列的具体机制尚不明确。当同一噬菌体或病毒再次侵染时，CRISPR序列在前导序列引导下转录出前crRNA，前crRNA接着被加工成小crRNA。这些crRNA与反式激活crRNA形成一种嵌合分子，被称为sgRNA(Single guide RNA)。最后，在sgRNA的作用下，Cas蛋白复合体干扰入侵噬菌体DNA序列 ，从而
10、使得宿主免受同一噬菌体的侵害8。CRISPR位点的间隔序列与细菌对特定噬菌体的抗性相关。图2 CRISPR系统作用机制Fig.2 The mechanism of CRISPR System2 CRISPR/Cas系统的应用Jiang等152014年构建了一个靶向人工合成的无功能的GFP基因的Cas9/sgRNA载体，无功能的GFP基因经修饰后成为有功能的GFP基因，从而转化成功的T1代植物中能观察到叶片组织中的绿色荧光信号。对6个T1代单株后分离的42个T2代植株的分析表明，50%的T2代为单拷贝插入。这项研究还发现CRISPR/Cas系统基因编辑是在遗传发育早期时完成的，并且完成修饰的位点
11、能稳定遗传至T2和T3代中。Brooks等16首次利用CRISPR/Cas系统建构2个sgRNAs来敲除番茄SlAGO7基因，通过根癌农杆菌法侵染番茄子叶获得转基因突变植株，对转基因后代分析CRISPR/Cas在番茄中诱导的突变能够稳定遗传给后代，但不排除存在脱靶效应。Jiang等17利用水稻原生质体转化Cas9/sgRNA建构靶向细菌性疫病的易感基因，OsSWEET14和OsSWEET11的启动子区域，测序结果显示靶标位点发生突变。有学者研究了2种水稻白叶枯病菌株(Xanthomonas oryzae)的CRISPR盒序列，发现其中1个菌系的CRISPR盒中虽然包含1段匹配Xop411基因组
12、的间隔片段，但依旧对Xop411噬菌体敏感。深入研究发现Xop411中与X.oryzae CRISPR间隔区段匹配的原初间隔区段发生突变，这与之前在嗜热链球菌及其噬菌体中观察到的结果相似18。3 CRISPR/Cas系统的展望CRISPR/Cas9等新型基因编辑技术开启了合成生物学时代19, 20。包括CRISPR/Cas基因编辑系统在内的新型生物技术有着广阔的应用前景。虽然这些技术本身不是问题，但如何用好这些新技术将是社会各界需要清醒认识的重要问题。在植物育种方面最大的问题在于通过这些技术产生的植物和相关产物是否受转基因相关法律约束。从科学角度来讲，新型植物育种方法产生的植物同经典方法产生的
13、植物可能是不可分辨的，且不会带来更高的健康与环境风险，这为监管工作带来更大的挑战21。此外，这些新型基因组编辑技术也引发了对专利等知识产权保护和社会伦理、法律等更多领域问题的思考22。参考文献1 Mahfouz M M, Piatek A, Stewart C N. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: challenges and perspectivesJ. Plant biotechnology journal, 2014, 12(8): 1006-1014.2 Lozano-Juste J, Cutler S R.
14、 Plant genome engineering in full bloomJ. Trends in plant science, 2014, 19(5): 284-287.3 Liu L, Fan X D. CRISPRCas system: a powerful tool for genome engineering J. Plant molecular biology, 2014, 85(3): 209-218.4 Nakata A, Amemura M, Makino K. Unusual nucleotide arrangement with repeated sequences
15、in the Escherichia coli K- 12chromosome J. Journal of bacteriology, 1989, 171(6): 3553-3556.5 Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studiesJ. Microbiology,
16、2005, 51(3): 653-663.6 Mojica F J, Garca- Martnez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements J. Journal of Molecular evolution, 2005, 60(2): 174-182.7 Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (C
