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1、RT-PCR和real-time PCR 原理及步骤,PCR定义,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。 多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。,PCR原理,10扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,RT-PCR原理,1.总RNA的提取。（试剂盒说明）,RT-PCR基本步骤,B
2、uffer dNTP混合物 引物 总RNA 逆转录酶 DEPC水 （试剂盒说明）,2.逆转录合成cDNA。,3.PCR及跑胶。,ddH2O 10mM dNTP 10PCR buffer Mgcl2 上游引物 下游引物 模板cDNA Taq 酶,Real-time PCR原理,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor
3、 (Intergen),荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。,定量PCR的数学原理,斜率与扩增效率,标准品,标准品梯度稀释方法,1、SYBR Green 法,SYBR Green 熔解曲线分析,SYBR Green法优缺点,优点: 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA 使用方便-不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜,Taqman 的优点 对目标序列有很高的特异性 特别适
4、合于SNP检测 与Molecular Beacons 相比设计相 对简单 Taqman 的缺点 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析,分子信标的优点 对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一 荧光背景低 分子信标的缺点 设计困难 无终点分析功能 只能用于一个特定的目标 价格较高,其他荧光标记方法,绝对定量与相对定量的定义,绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究,绝对定量通过
5、标准品定量,绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA PCR的产物,相对定量通过内标定量,内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,相对定量分析方法1 -Ct,前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT
6、（ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 CT=表达量的比值,相对定量分析方法2：双标准曲线法 目标基因与内参基因扩增效率不同,待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度,样品,DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间 DNA用量：0.05 ng 100 ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL,
