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1、1,RNA干扰技术抗HBV和HCV感染 研 究 动 态 郭顺明 解放军第105医院,2,引 言 RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术: 被科学杂志评为2002年世界十大科学进展之首，两名美国发现者获得了2006年诺贝尔医学奖。 RNA干扰技术和干细胞的基础研究： 近几年来医学领域的两大前沿性课题,未来十年内用于临床治疗病毒性肝炎的两大最具有挑战性的研究项目,3,目前临床用于抗HBV感染,干扰素,核苷类似物,不能完全清除cccDNA,抗病毒效果并不理想,4,RNA i作为一种新型的抗病毒基因治疗技术,高效、特异的 抗病毒作用,设计灵活的 多靶位效应,一种前景广阔的基因治
2、疗手段,5,定 义 在许多生物体中，当导入双链RNA(dsRNA)后会引起同源性基因的特异性沉默，这种现象称作RNA干扰（RNAi)。由于该现象先后在不同生物体中均被发现，不同的研究者给它作了不同的命名如植物学者称为共抑制或转录后基因沉默；线虫和果蝇研究者称它为RNAi;真菌研究者称为消除作用等。,6,确切的定义： 所谓RNA干扰是指细胞利用外源性或内源性小干扰RNA激发相关的酶复合物对同源性mRNA进行切割、降解，从而在转录后水平阻断基因的表达，达到同源基因的减效表达或不表达的过程。,7,RNAi的发现简史,90年代初，Rich Jorgensen 设想，将更多的色素基因注入植物体，能使花朵
3、的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，当时称共抑制（cosuppression)。 94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制 (quelling)。,8,95年Guo和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA 同样的结果特异性阻断该基因的表达，从而正式表明RNA 干扰现象的存在。,9,Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用
4、其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰（RNAi）。,10,RNAi现象的普遍性,随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。 RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。,11,RNA干扰的可能机制 RNA干扰现象广泛存在于真菌、植物、无脊椎动
5、物和哺乳动物的各种生物体中。利用双链RNA可以特异性地降解相应序列的mRNA，从而特异性阻断相应基因的表达。现在人们意识到这种现象之间存在着密切联系，可能在生物体内有着共同的生物学意义和相似的作用机制。,12,对RNAi的确切机制尚未完全清楚，但目前大量的研究表明RNAi主要以转录后基因沉默的方式对其同原mRNA的表达进行干涉的。大体分为三个过程：,13,转录后基因沉默发生的过程： （1）启动引发过程 外源性dsRNA 通过某种方法进入靶细胞内后，核酸切割酶识别外源的长dsRNA分子，并以一定的间隔将dsRNA分子切割成2123个核酸大小的小干扰RNA分子（small interference
6、 RNA,siRNA）;,14,(2)效应物形成过程 siRNA 与一种具有核酸酶活性的复合物（又称RNA诱导的沉默复合物，RISC） 结合，在ATP的作用下siRNA解旋，从而使沉默复合物由250Kda大小的前体转变为100Kda大小的沉默复合物活性形式，通过硷基互补配对的原则，siRNA识别与自身有同源序列的内源mRNA，并与之结合，然后具有活性的RNA诱导的沉默复合物将内源mRNA与siRNA结合的一段dsRNA切割下来，这样内源mRNA就被降解；,15,（3）RNAi的传递放大过程 dsRNA被切割下来后产生了更多的siRNA，这些siRNA又可使更多的靶mRNA转变成dsRNA，如此
7、构成一个循环往复的过程，通过这种方式RNAi现象还可传代给下一代,16,细胞膜,单链 RNA,dsRNA,dsRNA,2123nt dsRNA-核酸酶,RNAi核酸,mRNA,正义RNA,链互换,反义 RNA- mRNA 核酸酶,mRNA降解,RNAi或PTGS,17,18,RNA干扰现象的重要特征 （1）RNAi是转录后水平的基因沉默机制； （2）RNAi具有很高的特异性，能够非常特异性地降解与之序列相应的内源基因的,19,（3）RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的双链RNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达；
8、（4）RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持。 (5)有剂量依赖关系 （6）可以有效地与其他较成熟的基因功能研究方法结合使用,20,干扰RNA的制备 目前较为常用的制备的方法主要有： 直接化学合成法 化学合成修饰法 通过表达质粒载体体内转录 通过病毒载体转录等,21,已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默,体内实验可能会引起一定的免疫反应和不良反应,以腺病毒载体为代表，可以直 接高效率感染细胞，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便；而且转染效果更加稳定,病毒载体 转录,找到最有效HBV siRNA，需要大量siRNA进行研究,各种制备方法的
9、优缺点,22,RNAi技术与反义RNA技术的不同点 1.反义RNA技术所用的寡核苷酸链的长度并无特定限制，而RNAi所用的寡核苷酸片段均为2123pb的小RNA。 2.反义RNA技术的基因沉默来源于特定寡核苷酸对靶序列的封闭作用，并无酶切割作用，而RNAi技术则主要靠酶切。 3.反义RNA技作用于转录前，而RNAi技术作用于转录后。,23,RNAi对HCV复制和表达的作用 RNAi对HCV复制和表达有明显的阻断作用，作为RNA病毒的HCV的复制和翻译都局限在宿主细胞浆中，从而非常有利于RNAi技术发挥作用。 HCV基因组两侧的5UTR和3UTR、非结构区NS3 NS4A NS5B、开放读码框起
10、始部位的C区，都是RNAi抗HCV治疗的靶位。,24,很多学者在体外和体内进行了实验，都取得了可喜的成果。 Kapadia先用RT-PCR筛选针对NS3区和NS5B区的siRNA,将能抑制HCVRNA10倍以上的两种siRNA分别与表达HCV的质粒共转染Huh7细胞，2天后杂交结果显示抑制程度分别达5.7和8.3倍。 Wilson利用NS3区siRNA和NS5Bs区iRNA及HCV复制子共同电转染Huh7细胞，两种siRNA与对照组比较均能减少病毒蛋白的表达, HCVRNA的合成降底达90%以上。,25,RNAi对HBV复制和表达的作用 HBV 是DNA病毒，其复制时需要从前基因组 RNA逆转
11、录到DNA，这个过程在细胞浆中进行，利于RNAi的发挥。 HBV的X基因和P基因对HBV的复制起到关键作 用，所以X基因和P基因是RNAi起作用的主要靶 位点。,26,2003年以来RNAi技术抗HBV感染的研究报道开始增多，Shlomai用pSUPER质粒分别构建发夹X区 siRNA 和core 区siRNA的表达载体，与带有1.3倍长adw型HBV基因组的质粒载体共同转染Huh7细胞，杂交分析和印迹法显示：相应的HBV转录体和蛋白水平明显降低，所有复制形HBVDNA显著减少，X区siRNA组HBVDNA减少约95%，而core 区siRNA组仅减少40%。,27,刘顺爱等观察了针对乙型肝炎
12、病毒P 区基因的 RNA 干扰表达载体 pGE-HBVP 在 HepG2. 2. 1（52. 2. 15）细胞中抑制 HBV HBsAg和 HBeAg的分泌效应，结果不但 成功地构建了 5 个针对 HBV P 区的 RNAi 表达载体 pGE-HBVP1pGE-HBVP5，而且其中 pGE-HBVP1 和 pGE-HBVP2 具有明显的 HBsAg 和 HBeAg 分泌抑制效应和表达抑制效应。,28,抑制率最高的 pGE-HBVP2 在转染 2. 2. 15 细胞效率为 30% 40%的基础上，转染后 24、48、72 和96 h 培养上清中的 HBsAg 分泌抑制率分别为 28. 88% 、
13、32. 28% 、29. 10% 和 18. 42% ，HBeAg 的分泌抑制率分别为 38. 33%、27. 50%、33. 41%和 12. 60%。 细胞免疫细胞化学检测结果显示pGE-1 空载体转染后 2.2.15细胞的 HBsAg 的表达阳性率约为 82%，而 pGE-HBVP2 转染后 2.2.15 细胞的 HBsAg 的表达阳性率约为 50%，与 pGE-1 空载体相比阳性率显著下降。,29,应若素等以流体动力学法建HBV感染动物模型，将pcDNA3.1-HBV和体外细胞实验证明有效的小干扰RNA一同经尾静脉注射给BALB/c小鼠，用时间分辨免疫荧光分析法检测小鼠血清中乙型肝炎病
14、毒表面抗原水平，用荧光定量PCR检测血清HBVDNA水平，用逆转录PCR检测HBV c-mRNA,用免疫组织化学法检测肝组织表面抗原和核心抗原。结果显示，在小鼠体内siRNA能有效抑制HBV的复制，干扰效果至少持续3天以上。,30,唐霓等的研究结果表明，转染后第2天对HbsAg和HbeAg的抑制率达95%和85%。 但也有不同的实验结果，如蔡大川等依据RNA干扰原理设计针对核心相应序列，再将其克隆入含有聚合酶H1-RNA启动子的真核表达载体（psuper）,将此重组质粒以电转染法转入HepG2 2.2.15细胞中，结果没发现对细胞培养上清液表面抗原和e抗原表达的影响。,31,问题与展望,RNA
15、i是近年来才发现的一种古老的、保守的生物途径，是生物体适应外界环境、调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的重要机制，具有重大的生物学意义。 RNAi现已成为国内外研究的热点，不久前被Science评为2002年最重大科技突破。随着对RNAi机制研究的深入和RNAi技术的不断完善，RNAi有望成为治疗病毒感染性疾病的新方法。,32,存在的问题,目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移入体内成为RNAi应用的最大障碍； 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不清楚； 目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。,33,结 语 目前己确定RNAi是一种选择性地抑制几乎任 何基因在mRNA水平表达的有力科研手段。 迄今的研究已提供了在细胞培养和动物肝脏 中RNAi能够获得抗病毒活性的基本原理,已经 确定，通过 RNAi能够抑制HBV和HCV的复 制。,34,近两年该领域发展迅速而且它是目前重 要的课题。虽然该项研究还处在细胞水平阶段，也存在许多难题，但相信经过由细胞到动物体的进一步研究，RNAi技术不久很有希望直接用于临床抗病毒的治疗研究。希望在座的有志之士积极进行这方面的研究。,35,谢谢,
