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1、绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学 学院 摘 要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5 (克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。关键词：绿色荧光蛋白 克隆 表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆实验日期2015- 2015-实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、 实验目的1. 学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。2. 学习掌
2、握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。3. 掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。4. 学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。5. 了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。6. 掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。7. 掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、 实验原理1. pEGFP-N1质粒2. T载体三、 材料与方法：1. 实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5a(克隆菌)PCR引物：FGGCATATGGTGAGCAAGGGCGARCGG
3、GATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2. 方法分离目的基因限制酶切割目的基因与载体连接重组体转入受体细胞筛选重组体、转化子四、 实验具体流程1. 获取外源基因
4、1) 碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒彻底弃上清弃上清菌液离心1300r pm,1min瞬时离心加350l 溶液S3加250l 溶液S2加250l 溶液S1漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀取上清600l加到吸附柱中离心13000rpm,10min 颠倒数次离心 放置3-5min13000rpm,1min弃滤液，加入600l洗涤液W弃滤液，加入600l洗涤液W离心 离心放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加40l洗脱液13000rpm,1min 13000rpm,1minPCR扩增 / -20保存备用弃滤液空柱离心离心13000rpm,2min13000rpm,1min2) PCR扩增目
5、的基因GFP取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O6ml质粒DNA（pEGFP-N1）2ml引物GFP1 (10mM)1ml引物GFP2 (10mM)1mlPremix Taq10ml总体积20ml加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。PCE参数设置： 94预变性5分钟后开始以下循环 94 30 秒 56 30 秒 30 循环 72 1 分钟 72 7 分钟 4 保温3) 琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒凝胶准备胶床准备铺胶静置胶床置于电泳槽中加电泳缓冲液拔梳子上样（1mlPCR产物，6ml loading buffer
6、混合点样）点marker电泳取出凝胶拍照2. 构建重组DNA使用即用型蓝白T载体和快速DNA连接试剂盒。按下表加入试剂：为了检验转化是否成功，设置对照组实验实验组对照组即用型蓝白T载体1 ml1 mlPCR扩增产物1 mlControl Insert DNA1 ml快速连接缓冲液(2X)5 ml5 ml超纯水-ddH2O2.5 ml2.5 mlRapid T4 DNA ligase0.5 ml0.5 ml总体积10 ml10 ml添加完成后，冰箱内16反应45分钟3. 重组DNA的转化1) 预先制备好感受态细胞。2) 转化DNA，为了检验转化是否成功，设置对照组实验实验组：10ml PCR产物
7、/蓝白T载体连接产物+ 100ml感受态细胞阳性对照组：10ml Control Insert DNA/蓝白T载体连接产物+100ml感受态细胞阴性对照组：10ml无菌双蒸水 + 100ml感受态细胞步骤：（分别制作3组）将10mlDNA和100ml的感受态细胞加入试管中冰浴30min42水浴精确90s迅速转移至冰浴冷却1-2min加入800mlLB培养基恒温培养箱中37培养45min3) 检测重组DNA：涂布平板筛选步骤：取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素（Amp、X-gal、IPTG）的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟，倒置平皿37培养过夜。4. 重组DNA的
8、筛选培养的菌落在筛选培养基中，白色的菌落含有重组体pUC18，蓝色菌落则没有或只有载体pUC18。挑选白色单菌落扩大培养：用接种棒在白色单菌落上挑取菌落，接种于4mlLB/Amp+培养液中，37震荡培养过夜。5. 重组DNA的鉴定从扩大培养的菌液中提取重组质粒DNA，再进行限制性内切酶酶切，经行琼脂糖凝胶水平电泳。进行对照实验。剧烈震荡菌体沉淀扩大培养的菌液步骤：12000rpm 250ml250ml取600ml上清于吸附柱管1min 溶液S1裂解液S2 颠倒混匀4-6次350ml温和的颠倒混匀6-8次12000rmp 室温静置35min中和液S3直到出现白色絮状沉淀10min弃滤液空柱弃滤液
9、弃滤液 12000rmp600ml洗涤液W600ml洗涤液W30s12000rpm 30s12000rpm 30s收集洗脱液备用取吸附柱至另一新EP管 10000rpm50ml 室温静置 12000rpm2 min洗脱液1min1min洁净离心管2ml10 Buffer R10mLH2O6ml取5ml加1mlloading buffer混合取5ml，加1mlloading buffer混合混合后37水浴116h 2mlEcoR I电泳五、结果与讨论： 最后插入质粒中的DNA片段应为740bp，重组质粒大小应为3038bp+740bp=3778bp实验结果现象与讨论碱裂法提取质粒5000pEGF
10、P-N1质粒大小为4.7kb，电泳显示光带与marker5k相近，说明质粒提取较成功。电泳显示出两条带，可能原因：1、 加入S2时颠倒力度过大造成DNA断裂。2、 加入S2变形时间过长。3、 加入S3复性时间过长。4、 提取的质粒不够纯净。PCR扩增目的基因7502000只出现两条带，其中有接近750bp的光带，说明目的基因在PCR扩增中得到扩增。重组DNA的筛选12111111111实验组培养基中：1是蓝色菌落2是白色菌落阳性对照组培养基中只有白色菌落阴性对照组培养基中无菌落说明重组DNA较为成功。5000重组DNA的鉴定2000121是酶切DNA2是提取的质粒DNA当天实验使用的marker为2000bp。5000两个光带均亮度微弱，且均大于2000bp，酶切DNA没有出现740bp的光带。 111总结：在PCR扩增中，虽然有接近750bp的光带，但亮度微弱，说明在实验过程中，DNA破坏严重，所以到后面实验中，重组成功的细菌，量不多，光带亮度都微弱。而在实验过程中，我们在需要颠倒的步骤发现我们颠倒完后的管中出现气泡，这是其他小组没有的。所以经过总结，认为我们加入溶液时颠倒力度过大，导致质粒断裂，所以显示的光带亮度都比其他小组的暗。 最后鉴定中酶切DNA没有出现740bp的光带，可能原因也与上面所说的有关，在操作时我们也出现了气泡，认为是颠倒力度过大导致目的基因断裂。
