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1、温州大学本科毕业论文 乐清野生种群泥螺同工酶的生化遗传分析乐清野生种群泥螺同工酶的生化遗传分析 摘要：应用聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直平板电泳技术对乐清野生种群不同个体泥螺的苹果酸脱氢酶（MDH）、苹果酸酶（ME）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、酯酶（EST）和乳酸脱氢酶（LDH）等6种同工酶进行研究，得到其基本图谱，对其进行了生化遗传分析。共记录了20个基因座位，30个等位基因，其中7个基因座位（Mdh-1、Me-1、Me-2、Me-3、Pod-4、Est-4、Est-5）为多态。多态座位比例（P）为0.350，此结果与一般海洋贝类的多态座位比例（0.4710.159）相比偏低
2、，说明乐清野生种群泥螺的遗传变异能力低于一般海洋贝类。关键词：乐清野生泥螺；同工酶；生化遗传变异；Biochemical Genetic Analysis on Isoenzymes from Bullacta Exarata in Yueqing Wild stocksAuthor: Zheng Jingqian Supervisor: Associate Prof. Jia Shouju (School of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang, 325027)Abstract: 6 i
3、soenzymes including MDH, ME, SOD, POD, EST, LDH from different Bullacta exarata individuals in Yueqing Wild stocks were investigated by means of the discontinuous system of polyacrylamide gel electrophoresis in vertical plate. Biochemistry genetic analysis were conducted according to acquired electr
4、ophorogram. The results indicated that there were 30 alleles in 20 gene loci, 7 of which (Mdh-1, Me-1, Me-2, Me-3, Pod-4, Est-4 and Est-5) were polymorphic with P 0.350. So we concluded that the polymorphism in Bullacta Exarata individuals in Yueqing Wild stocks were below that of marine shellfish,
5、which represented ability for genetic variation of Bullacta Exarata were below the marine shellfish.Keywords: Yueqing Wild stocks; Bullacta exarata; Biochemical genetic variation;前言泥螺（Bullacta exarata）隶属于软体动物门（Mollusca）腹足纲（Gastropoda）后鳃亚纲（Opisthobranchia）中的阿地螺科（Atyidae）1。泥螺俗名很多，仅中国烹饪辞典中就收有“吐铁、麦螺、梅螺、
6、土螺、土铁（为吐铁的音误）、黄泥螺”等七个俗名2，称“麦螺、梅螺”是以食用的时令而命名的；称“吐铁”是以食用方法而命名的；称之为“泥螺”，是因为其食泥，故名，现食用泥螺较为普遍的江浙一带多以此名称之，很少有其他称呼。泥螺由贝壳和软体两部分组成，贝壳呈卵圆形，簿而透明，质脆，两侧内卷形成单调的、不明显的螺塔，塔上有密密的斜纹（将食后的螺壳逆光可清晰看出），壳口宽大，软体部从壳口探出。泥螺生活于海洋边缘的泥质或沙质滩涂上，食泥沙而吸收其中的有机质为生，行动与反应极为迟缓，与其他螺类不同的是：泥螺的壳与其软体部分极不相称，软体部分无法完全缩入壳内，软体内有一沙囊，起着胃的作用。泥螺的水孢（江浙一带赶
7、海人称未经加工的活泥螺为水孢，也称孢子），长约35 cm，宽约12 cm，从壳口探出的头盘约占整个身躯的3/5，肉质半透明，略带黄色或黑色（因品种而异）。泥螺在我国沿海均有分布，以黄海南部和东海北部以及勃海产为多，浙江的宁波、江苏的大丰和东台等地所产的泥螺较为著名。据海味索隐3记载：“吐铁，一名泥螺，出南田者佳。”南田，即今浙江宁波的南田县。又据随园食单3记载：“吐铁，出兴化、泰兴。”随着历史的变迁，大海与江苏的兴化、泰兴已相距甚远，泥螺也早已从这一带绝了迹，取代它们成为海边城市的是现在的大丰市、东台市和射阳县，它们东邻黄海，有着适合泥螺生长、繁衍的滩涂，泥螺也已成为这一带的特产。同工酶（is
8、ozyme）是指具有相同催化活性的不同结构形式的酶分子。1959年Markert和Moller4 发现乳酸脱氢酶在不同组织、不同个体及不同种中以不同的形式存在，导致同工酶概念的产生。同工酶有广义和狭义之分。早期同工酶的概念是广义的，指所观察到的全部带。包括了不同基因座位和同一基因座位的不同等位基因所编码的同一种酶，以及转录后的酶变体等所有酶电泳后的表现型。狭义的同工酶定义是仅指由不同基因位点所编码的同一种酶的不同形式5。1969年Prakash4等提出把同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式叫做等位酶（allozyme），把它从广义的同工酶概念中分出来。而对转录后产生的酶变体，属次
9、生性的同工酶，它们中有的可能是由实验条件引起的分子变化，未必都存在于天然生物体内，没有相对应的编码基因，不再处理为同工酶。首先利用电泳技术研究蛋白质的是Tiselius6。酶蛋白电泳始于20世纪50年代，Smithies7开始用淀粉凝胶电泳分离蛋白质。20世纪60年代酶电泳技术被引入群体遗传学，70年代以来同工酶电泳技术大量应用于昆虫学研究8，在分类学领域中，大量实验已证明同工酶电泳技术在属、种鉴定中是一项切实可行的实验手段。泥螺是中国江南沿海人们喜食的海产品。它含有人体必需的氨基酸如：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、缬氮酸等，泥螺足部必需氨基酸占氨基酸总量的54
10、.17%，泥螺肝部必需氨基酸占氨基酸总量的46.78%9，具有较高的营养价值。目前对泥螺的研究包括泥螺的蛋白质和氨基酸组分分析9、生态习性10、生殖系统11、养殖技术12、人工育苗13等方面，但未见对泥螺生化遗传方面的研究。本文对泥螺进行同工酶电泳并对其进行生化遗传分析，旨在研究泥螺种内变异能力，这将有利于泥螺生理生化方面的后续研究，并为开发泥螺养殖业，保护泥螺的种质资源提供一定的理论依据。1 材料和方法1.1 样本采集和保存2008年5月采集乐清野生种群泥螺个体。活体带回实验室，置于水族箱中以15海水晶配置的海水暂养48h，以排尽消化道中的泥沙等内容物。将泥螺置于冰盘中，活体剖开，取其斧足肌
11、，各个称量装袋，保存于-70的冰箱中备用。1.2 样本制备取不同个体泥螺斧足肌，按1:1（W/V）比例加入酶提取液（3mL 0.05mol/L（pH7.6）Tris-HCl缓冲液；内含0.9g蔗糖，0.0032g抗坏血酸，0.0022g半胱氨酸），在冰浴下置匀浆器中研磨，匀浆液于4冷冻离心机以12000r/min转速离心20min，取上清液分装，保存于-70冰箱中备用。1.3 电泳方法采用聚丙烯酰胺不连续垂直板平板电泳法。凝胶浓度及缓冲系统见表1。电泳设备为北京六一仪器厂的DYY-8C型稳压稳流电泳仪和DDY-28A型电泳槽，凝胶厚度为1.02.0mm，每管加样量随同工酶不同而不等（580L）
12、，以溴酚蓝作前沿指示剂，电泳于4冰箱中进行，稳定电流为1mA/管，当溴酚蓝指示剂进入分离胶界面时，稳定电流为2mA/管。表1 凝胶浓度及缓冲液Tab. 1 Gelatin Density and Buffer Solution同工酶浓缩胶浓缩胶缓冲液分离胶分离胶缓冲液缓冲系统苹果酸脱氢酶（MDH）7.5%Tris-HCl（pH8.8）2.5%Tris-HCl（pH6.8）Tris-Gly缓冲液（pH8.3）苹果酸酶（ME）7.5%Tris-HCl（pH8.8）2.5%Tris-HCl（pH6.8）Tris-Gly缓冲液（pH8.3）超氧化物歧化酶（SOD）7.5%Tris-HCl（pH8.8）
13、2.5%Tris-HCl（pH6.8）Tris-Gly缓冲液（pH8.3）过氧化物酶（POD）7.5%Tris-HCl（pH8.8）2.5%Tris-HCl（pH6.8）Tris-Gly缓冲液（pH8.3）酯酶（EST）7.5%Tris-HCl（pH8.8）2.5%Tris-HCl（pH6.8）Tris-Gly缓冲液（pH8.3）乳酸脱氢酶（LDH）7.5%Tris-HCl（pH8.8）2.5%Tris-HCl（pH6.8）Tris-Gly缓冲液（pH8.3）淀粉酶（AMY）7.5%Tris-HCl（pH8.8）2.5%Tris-HCl（pH6.8）Tris-Gly缓冲液（pH8.3）醇脱氢酶
14、（ADH）7.5%Tris-HCl（pH8.8）2.5%Tris-HCl（pH6.8）Tris-Gly缓冲液（pH8.3）以上采用相同的电极缓冲液（pH8.3 Tris-Gly 缓冲液（6g Tris，28.8g Gly，定容至1L，用时稀释10倍）进行电泳。1.4 电泳1.4.1 制板将两块玻璃板插进橡胶密封圈，用1%的琼脂（1g琼脂10mL电极缓冲液90mL重蒸水）把玻璃板与密封圈的边缘封上，注意保持胶室清洁。然后把封好的玻璃板装入垂直电泳槽中，再用琼脂封板，为防止漏胶，可以里外都封胶。待琼脂凝固之后，再进行灌胶。1.4.2 分离胶灌胶各种贮液的配制见表2。表2 贮液的配制Tab. 2 P
15、reparation of the Liquid贮液（100mL溶液中的含量）pHA（分离胶缓冲液）1mol/L HCl48 mL8.9Tris36gTEMED0.024mLB（浓缩胶缓冲液）1mol/L HCl48 mL6.7Tris5.9gTEMED0.046mLC（分离胶贮液）丙烯酰胺30g8.9甲叉丙烯酰胺0.8gD（浓缩胶贮液）丙烯酰胺10g6.7甲叉丙烯酰胺2.5gE核黄素4mg不用调pH值F蔗糖40g电极缓冲液（溶于1L水中，用时稀释10倍）Tris6g8.3甘氨酸28.8g将各种贮液按一定比例（A:C:E:水=1:2:1:4，A:TEMED=1mL:3L）混合（TEMED在最后倒胶前加入），然后将刚混合的凝胶溶液沿玻璃板倒入两块玻璃板之间，待凝胶液灌至离板上边沿约3cm处时即可。再用胶头滴管吸取少量重蒸水，小心地注入凝胶顶面，以防空气接触而引起胶面不平，从而影响电泳速度和分离效果。注水后，放在8
