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1、TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD,miRNA提取与检测,市场部 赵 丁,主要内容,什么是miRNA？,miRNA的作用,miRNA的研究路线,miRNA的提取及检测,4,1,2,3,miRNA的发现,1993年，Ambros在线虫中克隆了lin-4基因，并通过定点突变发现lin-4并不编码蛋白，而是产生一种小RNA分子。这种小RNA分子能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3非翻译端的特定区域相互作用来抑制lin-14的表达,最终导致lin-14蛋白质合成的减少,这种现象叫做转译抑制。lin-4控制着线虫幼虫由L1期向L2期的转化。 同时，Ruvkun也发现了l
2、in-4对lin-14的作用。,The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell,1993,miRNA的奠基者,miRNA相关文献数量,miRNA 的相关文献,什么是miRNA？,miRNAs（MicroRNAs）是一种不编码蛋白质，大小约21-23nt的单链小分子RNA。它具有在翻译水平或转录后水平调控基因表达的功能。,miRNA的合成过程,基因组DNA,Pri-miRNA（可达1000nt）,Pre-miRNA（70100nt）,
3、成熟miRNA,Dicer酶,Drosha酶,RNA 诱导沉默复合物,调控基因表达,Exportin 5,miRNA与靶mRNA的作用模式,1）二者不完全互补。即二者不完全时配对结合时，主要影响翻译过程，而对mRNA的稳定性无任何影响。如线虫的lin-4,2）二者完全互补。即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR-39/miR-171,3）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如let-7 果蝇/线虫,miRNA的特点,结构特异性：茎环结构前体，无ORF 高度保守性：结构和
4、物种 时空特异性：发育与分化 表达统计：60%的miRNAs 为独立表达 15%的miRNAs 成簇表达 25%的miRNAs 位于内含子,miRNA的作用,miRNA的主要作用在胚胎发生，发育时序，器官分化，程序性细胞死亡和生长控制（癌症）。,miRNA研究方法,生物信息学 构建miRNA文库 miRNA芯片 荧光定量PCR Nothernblot 原位杂交 其它方法,生物信息学,生物信息学,实验验证,miRNA芯片的公司,构建miRNA文库,生物信息学,实验验证,miRNA研究路线,miRNA,抽提和吸上清,沉淀RNA,PAGE电泳,裂 解,过柱,洗 脱,miRNA的提取,切胶回收,裂 解
5、,miRNA的提取,后续实验反应酶活 无法通过紫外来检测,信息的完整性 无法通过紫外和电泳来检测,-20度或-70度冻存 相对RNA来说，不易降解,纯 度,得 率,保 存,miRNA提取后的检测,对于少量血清/血浆提取，一般不建议进行紫外检测和电泳检测。对于低浓度的miRNA利用吸光值来确定miRNA浓度偏差较大，在有些时候仪器本身的误差即可造成测定结果的不准确。电泳的灵敏度更低，在很多情况下凝胶上并不会出现条带。,对于组织/细胞的提取，电泳时会出现明亮的条带，但条带中更多的是5SRNA和tRNA，紫外检测值无法准确的反映出miRNA的含量。,盐分的残留,天根DP501,PEG分离,DP501
6、可以显著的降低盐分的残留（230nm）。,反转录方法茎环,反转录方法加尾,荧光定量PCR,灵敏度,特异性,内参基因,5S rRNA U6,A,B,C,Pg级总RNA,单碱基差异,TIANGEN公司miRNA产品线,miRNA提取,miRNA加尾后反转录,miRNA荧光定量检测,miRcute miRNA提取分离试剂盒（DP501） 样本：组织、细胞、血清、血浆等。采用不同的protocol，可提取miRNA，也可提取总RNA。,miRcute miRNA第一链合成试剂盒（KR201） 通过对miRNA进行Poly（A）加尾，在已知序列的引物下，进行反转录，获得miRNA的cDNA。,miRcute miRNA qPCR 检测试剂盒（SYBR GREEN）（FP401） 高特异性（专利的抗体酶技术）、高分辨率（单碱基差异）、高灵敏度（pg级的总RNA）。,DP501对比实验,利用DP501提取20余样品未发现堵柱现象,DP501、KR201和FP401实验结果,mir-122 10倍倍比稀释 的扩增曲线、融解曲线 和标准曲线,TEL：86 010 59822665/2661 800-990-6057,TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.,THANK YOU!,
