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1、本科毕业论文（设计）题 目 基于纳米复合物的适体与免疫传 感器的制备与表征 学 院 _ _化学化工学院_ _ 专 业 _ 化学（师范） _ 年 级 _2008级_ 学 号 222008316011227 姓 名 _ _ _指 导 教 师 _ _ _ 成 绩 _良_ 2012年 4月9日目 录摘要1关键词1Abstract1Key words11 引言11.1 基于新颖的氧化石墨烯纳米复合材料非标记免疫传感器21.2 论文研究背景22 实验部分32.1 仪器与试剂32.2 凝血酶适体传感器32.3 免疫传感器的制备和表征52.3.1 免疫传感器的制备52.3.2 免疫传感器的电化学测量63 结果
2、与讨论63.1 凝血酶适体传感器的特性63.2 免疫传感器的特性73.2.1 银氧化石墨烯纳米复合材料的特性73.2.2 电化学免疫传感器的特性73.2.3 孵育时间优化83.2.4 免疫传感器的循环伏安响应和校准曲线93.2.5 免疫传感器的选择性、再现性和稳定性104 结论10参考文献1111基于纳米复合物的适体与免疫传感器的制备与表征李康西南大学化学化工学院, 重庆, 400715摘要：本文主要报道了基于氧化石墨烯与Hemin以及纳米Ag形成的纳米复合物的凝血酶适体传感器以及非标记免疫传感器。通过对各项实验条件的优化，制备的以银-氧化石墨烯复合物修饰的非标记免疫传感器能较好地利用于甲胎蛋
3、白（AFP）的电化学检测。该传感器具有较为快速灵敏和检测范围较宽的特点。关键词：适体传感器；免疫传感器；纳米复合材料；甲胎蛋白The preparation and characterization of aptamer and immunosensor based on nanocompositesLI KangSchool of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest China University, Chongqing 400715, ChinaAbstract: In this paper, thrombin aptasensor
4、and label-free immunosensor based on hemin-graphene oxide and silver- graphene oxide, respectively, was reported. Under the optimal detection condition, label-free immunosensor based on silver- graphene oxide was more suitable for electrochemical determination of -1-fetoprotein (AFP). The proposed s
5、ensor exhibited unique properties such as a rapid speed and wide linear range when used to detect AFP.Keywords: aptasensor; immunosensor; nanocomposite; -1-fetoprotein 1 引言适体（aptamer）是用配体指数富集法系统演化（SELEX）技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。通过SELEX技术筛选得到的适体不仅具有类似抗体对目标分子高亲和力和高特异性，分子量
6、小、结构简单、易合成和可进行连接性修饰等优点，而且具有反应速度快、可反复使用和长期保存等优点1。与抗体相比，适体作为生物传感器的敏感元件具有一定的优势，适体的出现为生物分析方法和传感器的设计开辟了新思路2。电化学传感器具有选择性好、灵敏度高、响应时间快、操作简单、价格低廉等等许多优点，再与适体的高特异性和选择性结合后，受到了研究者的广泛关注3。国内外有很多人员和小组都在此领域展开了创新性的工作4。适体电化学传感器根据是否标记可分为标记型和非标记型，都是通过检测电极表面电活性识别元素的电信号达到识别和鉴定靶物质的目的。免疫传感器是基于抗体和抗原能够发生特异性结合形成稳定的免疫复合物，并将特异性免
7、疫反应与高灵敏的传感技术结合起来，用以检测抗体和抗原反应的生物传感器。目前的研究领域广泛存在于临床诊断，环境分析，药物分析和食品安全等诸多方面，免疫传感器相对于其他分析仪器具有分析速度快、灵敏度高、选择性高、操作简便与成本低廉的优点，具有很广阔的发展前景。由于产生的信号不同，免疫传感器可分为质量检测免疫传感器、热量检测免疫传感器、光学免疫传感器和电化学免疫传感器4种类型。电化学免疫传感器是免疫传感器中研究得最多、最早并且最成熟的一个种类，具有选择性好、灵敏度高、检测速度快，成本低等优点。我们通过循环伏安实验测定实验中不同时间点的峰电流值来检测待测物的量。根据检测信号的产生来源是否自来标记物，电
8、化学免疫传感器又可以分为无标记型（直接测定）和标记型（间接测定）两种类型5。1.1 基于新颖的氧化石墨烯纳米复合材料非标记免疫传感器石墨烯是一个二维碳板，由于它的内在特性已成为材料科学领域一颗璀璨的新星，如高导电性、表面积大、机械强度大和良好的生物相容性。基于这些优点，石墨烯纳米复合材料极大地吸引了研究人员的注意力，因此，近些年来用于发展电化学生物传感器。然而，在水溶液石墨烯的不可逆聚集限制它的实际应用。氧化石墨烯，一种石墨烯的衍生物，基底平面与边缘含有大量含氧基团，使氧化石墨烯获得了亲水性，形成稳定均匀的氧化石墨烯悬浮液。而且，氧化石墨烯中含氧团体的一部分可以作为对接极性和无机纳米粒子的锚。
9、合起来，氧化石墨烯是石墨烯复合材料最好的基底。近些年，又由于用不同的纳米粒子填装氧化石墨烯纳米片的研究有很大进展，比如三氧化二铁、铅、氧化锌和金等等。其中，存储在氧化石墨烯上纳米片的金属纳米粒子由于良好的电导率和化学稳定性吸引了研究人员的关注。银纳米粒子不仅具有上述优点而且它独特的产品具有较高的催化活性和表面增强拉曼散射。针对这些优异的性能，银纳米粒子被广泛应用于电化学传感器和生物传感器等6。1.2 论文研究背景在这个人民生活水平日益增长的年代，健康已成为一个不容忽视的社会问题。凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血。用于外伤、手术、口腔、耳鼻喉、泌尿、烧伤、骨科、
10、等出血的止血。凝血酶能使纤维蛋白原转化成纤维蛋白。局部应用后作用于病灶表面的血液很快形成稳定的凝血块，用于控制毛细血管、静脉出血，或作为皮肤、组织移植物的黏合、固定剂。当药品中凝血酶的含量在标示量的80%以上时，才是有效的，因此测定凝血酶的含量是很关键的。可将凝血酶与适体传感器结合，通过测定电信号的强度而知凝血酶的含量。肝细胞癌是一个与肝脏有关联的癌症，是世界上癌症死亡最普遍的原因和致命的恶性肿瘤。然而,据报道,AFP在肝细胞癌患者的血清中含量较高，但是在健康人血清中的含量可相对忽略。所以AFP可作为诊断和预测处于早期阶段肝细胞癌的一个指标。基于夹心型免疫传感器的一些策略，如电化学和发光化学免
11、疫分析法，还有酶连接免疫吸附测定，都可应用于AFP的测定。但是，二次抗体的制备在这些方法中出现了一些问题，比如说，耗时间、操作复杂和高费用。与上述夹心型免疫传感器相比，非标记免疫传感器，就显得简单，而且容易操作，成本低。尤其是，没有必要合成二次抗体。2 实验部分2.1 仪器与试剂CHI660C电化学工作站（上海辰华仪器公司），BRANSONIC 200 超声清洗仪(德国BRANSON ULTRASCHALL 公司)，CS 501-SP 型超级数显恒温器(重庆四达实验仪器厂)，三电极体系。凝血酶、氯铂酸、氯金酸均购于 Sigma 公司(美国)，氨基凝血酶适体互补链，氨基凝血酶适体链，HRP，氨基
12、化二氧化硅，Hemin，PBS缓冲液(NaCl 137 mmolL1，KCl 2.7 mmolL1，Na2HPO4 10 mmolL1，KH2PO4 2 mmolL1)，0.5%戊二醛、葡萄糖，牛血清蛋白（96-99 %），硝酸银，氧化石墨烯，磷酸盐缓冲液。实验用水均为二次去离子水。2.2 凝血酶适体传感器首先合成二次抗体，取0.8 mL氨基化二氧化硅，离心取下层，加入pH=7.0的PBS缓冲液稀释至1 mL，加入500 L 0.5%戊二醛离心搅拌20 min后取其下层，用1 mL PBS洗涤一次后取下层用1 mL PBS缓冲液稀释，去0.5 mL溶液加入10 L 100 M氨基凝血酶适体链，
13、其余保持放置于冰箱中，将混合物离心搅拌20 min后倾去多余的戊二醛，滴入少量PBS缓冲液分散，即可得到所需的二次抗体。凝血酶适体传感器的构建过程如图1所示，先用0.05的氧化铝粉末打磨裸金电极，在放置超声仪中清洗，清洗完毕后取出晾干待用。首先，在预处理好的裸金电极表面滴6 L Hemin/GO，然后晾干形成Hemin/GO修饰的金电极。再将该电极插入浓度为2 ngmL-1的铂金酸溶液中，在电压为-0.2 V的条件下进行电沉积，电极表面得到一层纳米铂膜。接着，将20 L氨基凝血酶适体互补链AptamerI通过巯基与Pt的作用固载到电极表面，室温下放置16 h得到AptamerI/Pt/Hemi
14、n/GO修饰的金电极。然后AptamerII(20 L) 通过与AptamerI的碱基互补配对被组装到电极表面，之后用10 L 2 mgmL-1 HRP滴涂于电极表面进行封闭，冰箱放置6 h，即制得目标适体传感器。电极在不使用时放于4 的冰箱中保存。图 1 凝血酶适体传感器的组装过程示意图Fig. 1 The assembling process of thrombin aptasensor循环伏安法是测定修饰电极性质的一种常用的有效方法，实验测量以目标电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极。本文中的循环伏安实验是在室温下pH=7.0 的0.1 molmL-1 PBS缓冲液
15、里，-0.60 V （对饱和甘汞电极）电位区间，扫速为 0.1 Vs-1 条件下进行的。如图2所示，Hemin/GO修饰的金电极展现出一对明显的氧化还原峰(曲线B), Pt层的形成使得峰电流突然变大(曲线C)，而当AptamerI、AptamerII相继被组装到电极上时，峰电流逐步减小(曲线D、曲线E)，此外封闭剂HRP的作用使得峰电流几乎没有变化(曲线F)，这说明两条适体链靠非特异性吸附作用而结合在一起的可能性很小，最后，当目标适体传感器孵育0.5 nmolL-1凝血酶之后，峰电流反而下降了(曲线G)。这种测定方法是根据适体链与靶物质结合前后改变了电子传输阻碍力的大小，进而引起电流值的变化来对靶物质进行定量分析的，因为当靶物质与适体链的结合使得适体链从电极表面脱落下来，减小了电子传输过程中的阻力，进而使电流值增加。当传感器在靶物质中放置一段时间过后，其峰电流值将增大，且变化值会随着靶物质浓度的增加而增大。图2 凝血酶适体传感器表征曲线Fig. 2 CVs
