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1、HPLC法测定VB12注射液中VB12的含量一、实验目的1.学习HPLC分析条件的建立。2.练习HPLC仪器的使用。3.掌握HPLC分析系统适应性的考察方法及要求。4.掌握HPLC法测定样品含量的方法。二、实验原理高效液相色谱法的定量方法常采用外标法，外标法又分标准曲线法、一点法和两点法。当标准曲线法为过原点的直线时，则可用一点法进行含量测定，其误差主要来源于进样量不准确。在药物分析中，为了减少实验条件波动对分析结果的影响，常采用随行外标一点法，即每次测定都同时进对照品和样品溶液。在同一台仪器同样的分析条件下，进同样体积的对照品溶液和样品溶液分析，则有 A样 C样 A标 C标查资料可知VB12
2、紫外最大吸收波长在361nm左右,可在该波长处利用外标法对VB12进行含量测定。3、 仪器与试剂（1） 高效液相色谱仪（紫外检测器）;25L微量注射器。（2） C18反相健合相色谱柱（1504.6mm,5m).（3） 溶剂过滤器（0.45m）及脱气装置。（4） 0.2mg/mLVB12的甲醇溶液。（5） 甲醇（色谱）；重蒸馏水（新制）（6） 样品：VB12注射液（100g/mL）4、 实验步骤1、 流动相的配置量取甲醇和重蒸馏水（体积80：20）置量筒中混合后，用0.45m滤膜过滤脱气。2、 色谱条件固定相：C18反相健合相色谱柱（1504.6mm,5m)流动相：VB12为甲醇与水（体积80：
3、20）检测波长：361nm柱温：30oC3、 含量测定（1) 对照品溶液的配制精密称取VB12工作对照品适量2mg，置10mL量杯中，加甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀。（2） 样品溶液的配制精密量取样品注射液0.1mL，置250mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀。精密量取1mL置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度线，摇匀后备用。（3） 精密吸取对照品和样品溶液10L,分别注入高效液相色谱仪进行分析，根据对照品和样品溶液色谱图的峰面积用标准品对照法计算其注射剂中VB12的含量。5、 数据记录及处理（1) 色谱条件如下色谱柱： 柱温： 流动相： 流速： 检测器： 检测波长：(2)记录组分名、保留时间、峰宽等参数，分别计算对照品和样品的理论塔板数、理论踏板高度、拖尾因子及两者的分离度。tRWnHTRs对照品样品溶液峰面积AC样/(mg/mL)对照品样品（3）峰面积记录
