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1、胰岛素(E.Coli)生产流程,人胰岛素的制备方法,人胰腺提取-原料来源有限 通过单个氨基酸化学合成-生产成本太高 猪胰岛素转化或“半合成”-成本高，来源少 基因工程菌发酵 -双链Genentech,开发，Eli Lilly 放大 -胰岛素原（82个氨基酸，胰岛素的前体） -分泌法（Yeast），Novo Nordisk产业化 -细胞内法（E.coli），表达121+82个氨基酸的Trp-LE-Met-proinsulin包涵体，Eli Lilly 产业化,E.Coli胰岛素原法 转化流程,市场分析和设计基础（2005）,糖尿病人数：美国1800万，全世界1.5-2.0亿，年增长率3-4% 胰
2、岛素年销售额35-40亿美元, 由Novo Nordisc、Eli Lilly和Sanofi Aventis三家垄断 每个患者每年购买胰岛素的花费：$250-750 每个病人每年平均用量：0.5克纯胰岛素 对1.5-2.0亿患者，年需求75-100吨纯胰岛素 目前年产量20-30吨纯胰岛素 设计年产量：1800kg纯胰岛素，满足350万人 年工作330天，每48小时生产一批次，每年160批次 每批次发酵液体积：37.5立方米， 发酵罐空罐体积：50立方米,人重组胰岛素（E.coli）生产流程,发酵工段 初回收工段 反应工段 终纯化工段,通气量： 0.5VVM,空罐体积：50立方米 前接2级种子
3、罐 发酵周期：18小时 发酵温度：37度 终菌密度：30克（干重）/升 包涵体含量：干重的20% 终保温：10度,发酵工段,初回收工段物料温度保持10度,-三个平行的碟片式离心机收获菌体 -菌液从37000L浓缩到9165L菌泥 -菌体收率98%,加与菌泥等体积的缓冲液(96.4%w/w WFI注射用水, 0.7%EDTA, 和2.9% TRIS-base)稀释,有利于菌体碎片与包涵体分离,三次高压匀浆机破菌释放包涵体 压降800bar,终物料体积： 1400L,用前面的碟片式离心机回收包涵体收率98%,加2倍体积的清洗剂(0.66% Triton-X100), 洗涤包涵体,反应工段溶解包涵体
4、,玻璃反应釜内加终浓度为300g/L(5M)的尿素（溶解变性蛋白）和40g/L的 2-巯基乙醇（减少二硫键的结合）,反应时间：8小时 溶解收率：95%,包涵体内Trp-LE-Met-proinsulin 含量 ：80% w/w,WFI透析6小时， 收率98%， 去除尿素和 2-巯基乙醇,过滤去除细小颗粒，保护后续层析柱。 终体积5200L,再次离心，去除菌体碎片和可溶性蛋白 共用前面回收工段的碟片离心机,反应工段嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解为121个氨基酸的Trp-LE-Met和82个氨基酸的Proinsulin,70%甲酸溶液 30倍过量加入CNBr (理论摩尔比1:1) 收率95%,反应时
5、间：12小时 反应温度：20度 利用前面溶解反应釜,在CNBr沸点35度旋转真空蒸发1小时,会产生少量有毒氰化物气体，现场应准备次氯酸盐,亚硫酸分解的目的是打开胰岛素原和二硫键，给半胱氨酸加上SO3部分,pH 9-11，50%w/w(6M)盐酸胍，0.35%碳酸氢铵，3%硫酸钠，1.5%过硫酸钠，反应时间12小时，收率95%,WFI透析至盐酸胍浓度为20%w/w,共用前面包涵体溶解过程的透析器,反应工段再折叠,三个平行阳离子交换层析床纯化proinsulin,床直径：140cm 床高度：25cm 填料：SP Sepharose FF, GE 洗脱液：29% w/w尿素，1.5%NaCl, 69.5%WFI,pH4 收率90%,再折叠的目的是去除SO3，然后使二硫键形成，并再折叠成胰岛素原的正确天然结构,加入巯基乙醇,反应工段酶转化,终纯化工段,终纯化工段,
