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1、肽类药物的含量测定方法,背景：多肽类药物及其主要优势人体的生长和发育都离不开多肽，多肽是调节系统功能和细胞生长的基础。多肽类药物作为药物开发的主要方向，它包括多种类型，常见的多肽类药物有如下几种 .多肽类疫苗：多肽类疫苗的研制为人类攻克肝炎、艾滋病 等疾病带来了希望。 .抗肿瘤多肽类药物：肿瘤危害人类的生存，其产生是多方 面因素共同作用的结果，但归根到底是癌基因表达的问题。多肽类抗癌药物由于其能够成为肿瘤基因表达时的调控因子，因而成为了抗癌药物研究的新希望。 .抗病毒类多肽药物：一般来说，病毒感染细胞的过程包括以下几个主要阶段：吸附、自我复制、重新组合、释放病毒等。抗病毒多肽通常作用于病毒吸附
2、和病毒复制两个阶段，通过与宿主细胞特异性结合或者病毒蛋白酶结合来发挥作用。,一 、酸碱滴定法,示例：苯酪酞的测定,测定方法：取本品约0.5g精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液呈中性）60ml，振摇，溶解后加酚酞指示液数滴，用氢氧化钠滴定（0.1mol/L)，即可。,二、 紫外分度光度法,示例：五肽胃泌素含量测定,五肽胃泌素为白色或类白色粉末。本品能促进胃酸、胃蛋白酶及内因子的分泌，其促胃酸分泌作用相当于内源性胃泌素的1/4，作用可持续1040分钟。临床上主要用于胃酸分泌机能的检查。,方法原理： 供试品加0.01mol/L氨溶液定量稀释，制成供试液，置紫外可见分光光度计,于280nm波长处测定吸
3、收度，计算出其含量。 试剂： 氨溶液（0.01mol/L） 标准品：E1%1cm 为70计算 仪器设备： 紫外可见分光光度计,注：分光光度法应以配制供试品的同批溶剂为对照，采用1cm的石英吸收池。以吸收度最大的波长作为测定波长，一般供试品的吸收度读数，以在0.3-0.7之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则测得的吸收度偏低。狭缝宽度的选择，应以减少狭缝宽度时供试品的吸收度不再增加为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。,三、效价测定法,实例（1）：抑肽酶效价的测定,抑肽酶(Trasylol，别名：抑胰肽酶、屈来密
4、多) 能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。临床用于预防和治疗急性胰腺炎、纤维蛋白溶解引起的出血及弥漫性血管内凝血。还可用于抗休克治疗。在腹腔手术后，直接注入腹腔可预防肠粘连。,抑肽酶通过酶上的丝氨酸活性部分，形成抑肽酶-蛋白酶复合物而达到抑制作用。然而与不同的蛋白酶结合，显示出不同的离解常数。与胰蛋白酶的结合最牢固与人体纤溶酶的结合不很牢固。,（1）底物溶液的制备,(2) 胰蛋白酶稀释溶液的制备,精密量取胰蛋白酶溶液1ml，用硼砂氯化钙缓冲液（pH 8.0）稀释成20ml，室温放置10min，置于冰浴中。,取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐171.
5、3mg，加水溶解并稀释至25ml。临用时配制。胰蛋白酶溶液的 制备 取胰蛋白酶对照品适量，精密称定，加盐酸滴定液（0.001mol/L）溶解并制成每1ml中约含0.8单位（每1ml中约含1mg）的溶液，临用时配制并置于冰浴中。,(3) 供试品溶液的制备,取本品适量，精密称定，加硼砂一氯化钙缓冲液（pH 8.0）溶解并制成每1ml中约含1.67单位（每1ml中约含0.6mg）的溶液，精密量取0.5ml与胰蛋白酶溶液2ml，再用硼砂一氯化钙缓冲液（pH 8.0）稀释成20ml，反应10分钟，置冰浴中（2小时内使用）。,(4) 测定法,取硼砂氯化钙缓冲液（pH 8.0）9.0ml与底物溶液1.0ml
6、，置25ml烧杯中，于250.5恒温水浴中放置35分钟，在搅拌下滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）调节pH值为8.0，精密加入供试品溶液（经25保温35分钟）1ml，并立即计时，用1ml微量滴定管以氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定释放出的酸，使溶液的pH值始终保持在7.98.1。每隔60秒读取pH值恰为8.0时所消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的体积（ml），共6分钟。另精密量取胰蛋白酶稀释溶液1ml，按上法操作，作为对照（重复一次）。以时间为横坐标，消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）为纵坐标作图，应为一条直线。供试品和对照两条直线应基本重合，求出每秒钟消耗氢氧化钠滴定
7、液（0.1mol/L）的体积（ml），按下式计算。,每1mg抑肽酶的效价（单位）,式中 4000为系数； W为抑肽酶制成每1ml中约含1.67单位时的酶量，mg； n1为对照测定时每秒钟消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的体积，ml； n2为供试品溶液每秒钟消耗氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的体积，ml； 2为供试品溶液中所加入胰蛋白酶的量为对照测定时的2倍； f为氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）校正因子。,效价单位定义 能抑制一个胰蛋白酶单位每秒钟能水解1mol的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为一个胰蛋白酶单位（microkatal）的活力称为一个抑肽酶活力单位（EPU）
8、。每1EPU的抑肽酶相当于1800KIU。,注意事项： （1）本实验测定原理：在一定条件下（pH8.0，25），胰蛋白酶可使N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯水解为N-苯甲酰-L-精氨酸，使溶液pH下降，当加入氢氧化钠滴定后，使溶液pH又回到8.0，水解继续进行。 （2）当胰蛋白酶中加入抑肽酶后，使50%的胰蛋白酶活性被抑制，剩余的胰蛋白酶继续与底物进行水解反应，用氢氧化钠滴定释放出的酸，使pH始终维持7.98.0，在一定时间内，根据根据样品消耗的氢氧化钠（0.1mol/L）的体积（ml)算出活力单位。,实例（2）杆菌肽效价测定： 利用杆菌肽能够抑制微生物生长特性，进行实验设计。通过与标准品对微生物产
9、生抑菌圈面积的大小，从而得到待测样品相对与标准品的效价,实例（3）缩宫素的效价测定 利用缩宫素的能够改变小鼠子宫的收缩程度，来进行实验设计。通过与标准品对子宫收缩程度进行比较，从而得到该药物相对于标准品的效价。,总结： 在进行多肽药物含量进行测定时可以采用了两种形式： 第一种属于比较精准的定量如酸碱滴定法和紫外分光光度法。这两种方法都是利用多肽分子结构上的特点。方法一利用游离的氨基或羧基，使多肽表现出酸碱性，可以利用低浓度酸或碱进行滴定；方法二利用某些特性的官能团来进行定量。因此再要进行对某种多肽物质进行定量时，可以从结构特性下手，利用特性化学反应或者物理特性进行定量。 第二种属于一种比较抽象的定量方式效价测定。跟酶活力单位类似是一个可以随人为规定变化而变化的，但通过规定统一标准，具有可比性。在效价测定的实例中，可以得出它们都是基于该多肽药物具有某种特殊的药效。抑肽酶可以抑制抑制胰蛋白酶的活性，杆菌肽可以抑制藤黄微球菌的生长，缩宫素可以促进子宫的收缩。因此在测定某多肽药物的效价时，可以结合该药物所具有的特定功能进行实验设计，来测定其效价！,谢谢观看！ 2020,
