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1、肽类药物的含量测定方法,背景:多肽类药物及其主要优势人体的生长和发育都离不开多肽,多肽是调节系统功能和细胞生长的基础。多肽类药物作为药物开发的主要方向,它包括多种类型,常见的多肽类药物有如下几种 .多肽类疫苗:多肽类疫苗的研制为人类攻克肝炎、艾滋病 等疾病带来了希望。 .抗肿瘤多肽类药物:肿瘤危害人类的生存,其产生是多方 面因素共同作用的结果,但归根到底是癌基因表达的问题。多肽类抗癌药物由于其能够成为肿瘤基因表达时的调控因子,因而成为了抗癌药物研究的新希望。 .抗病毒类多肽药物:一般来说,病毒感染细胞的过程包括以下几个主要阶段:吸附、自我复制、重新组合、释放病毒等。抗病毒多肽通常作用于病毒吸附
2、和病毒复制两个阶段,通过与宿主细胞特异性结合或者病毒蛋白酶结合来发挥作用。,一 、酸碱滴定法,示例:苯酪酞的测定,测定方法:取本品约0.5g精密称定,加中性乙醇(对酚酞指示液呈中性)60ml,振摇,溶解后加酚酞指示液数滴,用氢氧化钠滴定(0.1mol/L),即可。,二、 紫外分度光度法,示例:五肽胃泌素含量测定,五肽胃泌素为白色或类白色粉末。本品能促进胃酸、胃蛋白酶及内因子的分泌,其促胃酸分泌作用相当于内源性胃泌素的1/4,作用可持续1040分钟。临床上主要用于胃酸分泌机能的检查。,方法原理: 供试品加0.01mol/L氨溶液定量稀释,制成供试液,置紫外可见分光光度计,于280nm波长处测定吸
3、收度,计算出其含量。 试剂: 氨溶液(0.01mol/L) 标准品:E1%1cm 为70计算 仪器设备: 紫外可见分光光度计,注:分光光度法应以配制供试品的同批溶剂为对照,采用1cm的石英吸收池。以吸收度最大的波长作为测定波长,一般供试品的吸收度读数,以在0.3-0.7之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度,否则测得的吸收度偏低。狭缝宽度的选择,应以减少狭缝宽度时供试品的吸收度不再增加为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收,因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数,再计算含量。,三、效价测定法,实例(1):抑肽酶效价的测定,抑肽酶(Trasylol,别名:抑胰肽酶、屈来密
4、多) 能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶,阻止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。临床用于预防和治疗急性胰腺炎、纤维蛋白溶解引起的出血及弥漫性血管内凝血。还可用于抗休克治疗。在腹腔手术后,直接注入腹腔可预防肠粘连。,抑肽酶通过酶上的丝氨酸活性部分,形成抑肽酶-蛋白酶复合物而达到抑制作用。然而与不同的蛋白酶结合,显示出不同的离解常数。与胰蛋白酶的结合最牢固与人体纤溶酶的结合不很牢固。,(1)底物溶液的制备,(2) 胰蛋白酶稀释溶液的制备,精密量取胰蛋白酶溶液1ml,用硼砂氯化钙缓冲液(pH 8.0)稀释成20ml,室温放置10min,置于冰浴中。,取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐171.
5、3mg,加水溶解并稀释至25ml。临用时配制。胰蛋白酶溶液的 制备 取胰蛋白酶对照品适量,精密称定,加盐酸滴定液(0.001mol/L)溶解并制成每1ml中约含0.8单位(每1ml中约含1mg)的溶液,临用时配制并置于冰浴中。,(3) 供试品溶液的制备,取本品适量,精密称定,加硼砂一氯化钙缓冲液(pH 8.0)溶解并制成每1ml中约含1.67单位(每1ml中约含0.6mg)的溶液,精密量取0.5ml与胰蛋白酶溶液2ml,再用硼砂一氯化钙缓冲液(pH 8.0)稀释成20ml,反应10分钟,置冰浴中(2小时内使用)。,(4) 测定法,取硼砂氯化钙缓冲液(pH 8.0)9.0ml与底物溶液1.0ml
6、,置25ml烧杯中,于250.5恒温水浴中放置35分钟,在搅拌下滴加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)调节pH值为8.0,精密加入供试品溶液(经25保温35分钟)1ml,并立即计时,用1ml微量滴定管以氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定释放出的酸,使溶液的pH值始终保持在7.98.1。每隔60秒读取pH值恰为8.0时所消耗的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的体积(ml),共6分钟。另精密量取胰蛋白酶稀释溶液1ml,按上法操作,作为对照(重复一次)。以时间为横坐标,消耗的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)为纵坐标作图,应为一条直线。供试品和对照两条直线应基本重合,求出每秒钟消耗氢氧化钠滴定
7、液(0.1mol/L)的体积(ml),按下式计算。,每1mg抑肽酶的效价(单位),式中 4000为系数; W为抑肽酶制成每1ml中约含1.67单位时的酶量,mg; n1为对照测定时每秒钟消耗的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的体积,ml; n2为供试品溶液每秒钟消耗氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的体积,ml; 2为供试品溶液中所加入胰蛋白酶的量为对照测定时的2倍; f为氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)校正因子。,效价单位定义 能抑制一个胰蛋白酶单位每秒钟能水解1mol的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为一个胰蛋白酶单位(microkatal)的活力称为一个抑肽酶活力单位(EPU)
8、。每1EPU的抑肽酶相当于1800KIU。,注意事项: (1)本实验测定原理:在一定条件下(pH8.0,25),胰蛋白酶可使N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯水解为N-苯甲酰-L-精氨酸,使溶液pH下降,当加入氢氧化钠滴定后,使溶液pH又回到8.0,水解继续进行。 (2)当胰蛋白酶中加入抑肽酶后,使50%的胰蛋白酶活性被抑制,剩余的胰蛋白酶继续与底物进行水解反应,用氢氧化钠滴定释放出的酸,使pH始终维持7.98.0,在一定时间内,根据根据样品消耗的氢氧化钠(0.1mol/L)的体积(ml)算出活力单位。,实例(2)杆菌肽效价测定: 利用杆菌肽能够抑制微生物生长特性,进行实验设计。通过与标准品对微生物产
9、生抑菌圈面积的大小,从而得到待测样品相对与标准品的效价,实例(3)缩宫素的效价测定 利用缩宫素的能够改变小鼠子宫的收缩程度,来进行实验设计。通过与标准品对子宫收缩程度进行比较,从而得到该药物相对于标准品的效价。,总结: 在进行多肽药物含量进行测定时可以采用了两种形式: 第一种属于比较精准的定量如酸碱滴定法和紫外分光光度法。这两种方法都是利用多肽分子结构上的特点。方法一利用游离的氨基或羧基,使多肽表现出酸碱性,可以利用低浓度酸或碱进行滴定;方法二利用某些特性的官能团来进行定量。因此再要进行对某种多肽物质进行定量时,可以从结构特性下手,利用特性化学反应或者物理特性进行定量。 第二种属于一种比较抽象的定量方式效价测定。跟酶活力单位类似是一个可以随人为规定变化而变化的,但通过规定统一标准,具有可比性。在效价测定的实例中,可以得出它们都是基于该多肽药物具有某种特殊的药效。抑肽酶可以抑制抑制胰蛋白酶的活性,杆菌肽可以抑制藤黄微球菌的生长,缩宫素可以促进子宫的收缩。因此在测定某多肽药物的效价时,可以结合该药物所具有的特定功能进行实验设计,来测定其效价!,谢谢观看! 2020,