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1、K 蛋白质组数据分析,1 什么是蛋白质组学( what) 2 蛋白质组学的产生(why) 3蛋白质组学研究方法 4 蛋白质组学分类(了解) 5 蛋白质组学的研究现状 (了解),什么是蛋白质组？,蛋白质组 “proteome”一词源于“PROTEin”与“genOME”的杂合 是指“由一个基因组、一种生物或一个细胞/组织的基因组所表达的全套蛋白质”,荧光染色的细胞内蛋白质,为什么研究蛋白质组？,（2）有限与无限 对于基因组而言，其核苷酸的数量是明确的。 然而，对蛋白质组来说，由于细胞内的大部分蛋白质通常都被进行过翻译后修饰，主要有磷酸化、糖基化、酰基化等。修饰过的蛋白质具有其特定的物理化学性质和
2、生物学功能。 因此对蛋白质修饰的研究已构成了蛋白质组研究的一个重要部分：修饰蛋白质组学。如果把一个修饰蛋白视为一种新的蛋白，那么蛋白质组的蛋白质数量将远远大于相应的基因组的基因数量。 从这种意义上说，对基因组核苷酸序列的测定是一种“有限”的工作，而对蛋白质组的蛋白质种类的确定则是一种“无限”的工作。,Shotgun identification of protein modifications from protein complexes and lens tissue,PNAS 2002 vol. 99 no. 12,Fig. 1. The identification of glycoge
3、n phosphorylase and ovalbumin protein modifications within a simple protein mixture. The protein modifications identified with overlapping peptide coverage are displayed with phosphorylation in blue, acetylation in yellow, and oxidation in red.,规模化蛋白质翻译后修饰识别,（3）静态与动态 一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。 而作为新陈代谢
4、的主要执行者的蛋白质组，在个体的生命活动中却是不停变动的。蛋白质的差异和变化是生命活动的重要体现方式，发现在正常和病理状态下出现差异的蛋白质常常是认识和防治疾病的关键。因此现在大多数研究都是针对蛋白质的差异表达谱。,The complexity of proteome. One gene - multiple proteins,人类基因组计划已完成3-4万个基因，30亿对碱基，而目前研究发现表达的蛋白质 超过250,000 个,而这些蛋白仅仅只占人类蛋白的2%-5%,“多样性”,（4）时间和空间 DNA通常位于细胞核内，且保持稳定，因此测定基因组的DNA序列是不受时空的影响。 对于mRNA来说
5、，时间是主要的参考因素，在发育的不同阶段或细胞的不同活动时期，mRNA的表达是不一样的。因此，在研究转录组或基因芯片时必须考虑到时间，但通常不需要考虑空间的影响。,而在蛋白质组的研究中，不仅要考虑时间的因素，更要考虑空间的影响。首先，不同的蛋白质分布在细胞的不同部位。它们的功能与其空间定位密切相关。其次，许多蛋白质在细胞里不是静止不动的。 因此蛋白质组学又派生了一个与空间紧密相关的新研究领域亚细胞器蛋白质组学。,大规模、全方位的蛋白质研究势在必行,生命科学的研究正步入崭新的蛋白质组学时代。,2001年,国际人类蛋白质组组织(HUPO)正式成立,美国、英国、法国、德国、澳大利亚、日本等国也分别投
6、入巨资进行蛋白质组学的研究.,2002年北京蛋白质组研究中心主任贺福初院士领衔的中国科学家团队率先提出了“人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）”,蛋白质组研究方法 主要内容,蛋白质组研究概述 蛋白质组研究技术 蛋白质组分类（了解） 蛋白质组学的研究现状 (了解),蛋白质样品制备 (sample preparation) 蛋白质的分离 蛋白质的鉴定 生物信息学研究,蛋白质组研究流程图,Sample Prep,2-D GELS,MASS SPEC MALDI-TOF,Spot Cutter Protein Digest MALDI Spotting,Sample,SWISS-PROT/ TrEMBL,
7、ESI MS/MS,Imaging,D/BASE,PepSeq,蛋白组学研究过程,SWISS PROT/ TrEMBL,MicroMass ABI Bruker,样品,样品制备,2维电泳,纯化和点样,质谱测序,数据库分析,成像,蛋白质组研究平台,蛋白质组学研究技术 （Technology of Proteomics）,蛋白质组研究的三大基本支撑技术：,大规模蛋白质分离技术-双向电泳技术,高通量蛋白质鉴定技术质谱技术,计算机图像分析与大规模数据处理技术,蛋白质组研究三个主要 技术步骤： 双向电泳分离 质谱鉴定 生物信息学,一维聚丙烯酰铵凝胶电泳 1-D PAGE(one-Dimensional
8、PolyAcrlamid Gel Electrophoresis),聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式: 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE) 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,蛋白质的分离技术,大规模蛋白质的分离技术2-DE Two-Dimensional Gel Electrophoresis,二维凝胶电泳概述 1975年，OFarrell et al 发明了双向电泳技术。 一个细胞有5000-6000种不同蛋白，人体有250种细胞，每 个细胞表达300-400种自身特有蛋白 能检测到3000-4000种总蛋白，最大可达到一万种,二维凝胶电泳
9、（2-DE）二维电泳又称双向电泳，是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离分析方法。 工作原理： 1st dimension: isoelectric focusing (IEF) 蛋白质根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中分离(pI) 2nd dimension: SDS-PAGE 蛋白质根据相对分子质量大小不同进行分离(Mr),Principle of 2D-PAGE,2D Gel-Based Proteomics,2D-Gel Electrophoresis,2D-PAGE的分辨率和重复性,“分辨率” 目前，一块胶板(16cm20cm)可检测到30004000个甚至1
10、0000个蛋白斑点； “重复性” 80年代开始采用固定化pH梯度胶的IEF，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度，可建立很窄的pH范围(0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域做第二轮分析，大大提高了分辨率。固定化pH梯度胶已有商品生产，基本解决了重复性的问题；,“高通量”与“自动化”,大规模蛋白质分离技术2-DE,2-DE是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，成为蛋白质组研究中首选的分离技术,2-DE的局限性 低丰度蛋白、膜蛋白、碱性蛋白的分离与检测 重复性,UV Detector,pH Monitor,UV Detector,PA
11、 800 MALDI/TOF,1st Dimension Chromatofocusing,Fraction Collector/Injector,2nd Dimension Reverse Phase,ESI/MS,Injector,工作原理：第一维色谱:离子交换色谱； 第二维色谱:反相色谱,大规模蛋白质分离技术 二维色谱分离技术（2D-HPLC）,ProteomeLabTM PF-2D 目标蛋白快速分离系统,蛋白质鉴定技术 质谱技术( mass spectrometry),生物质谱技术平台： 电喷雾电离质谱（ESI-MS） 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）,对二
12、维凝胶电泳或二维色谱分离的蛋白质进行快速、灵敏、准确的识别与鉴定，是蛋白质组研究所面临的又一重大挑战,The Five Mass Spectrometry Nobel Prize Pioneers,生物质谱技术获得2002年诺贝尔化学奖,质谱在蛋白质鉴定中的重要地位,质谱技术,Nature (2003) 422, 198-207,质谱技术,Nature (2003) 422, 198-207,MALDI-TOF,ESI-Q-TOF,ABI 4700 MLDI-TOF/TOF,计算机图像分析与大规模数据处理技术,计算机图像分析： 2d胶图扫描及2d图像分析 质谱图像数据分析,大规模数据处理技术：
13、 双向电泳图谱数据库 质谱数据信息处理及数据库搜索 “bioinforamatics”,2D-Gel Electrophoresis,Proteomics Ananlysis in the Control and Experimental,计算机图像分析,大规模数据处理,2D Gel Databases,Biobase 角质形成细胞,膀胱癌等 (丹麦Center for Genome Research) http:/biobase.dk/cgi-bin/celis ECO2DBASE 大肠杆菌 (在NCBI库中) ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/respository/ECO2DB
14、ASE Heart-2DPAGE 人心肌 (德国柏林) http:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleiss HSC-2DPAGE 人类心脏 (英国Harefield, Heart Science Center) http:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.html LSB 人类,小鼠和大鼠肝脏等 (美国Large Scale Biology) .2dmaps/patterns.html QUESTRef52 细胞,大鼠胚胎,酵母 (美国Cold Spring Harbor Lab) http:/si
15、va.cshl.org/ SWISS-2DPAGE 十个人类图谱,包括: 肝, 浆细胞, 红细胞, 血小板, 以及酵母, 大肠杆菌 (瑞士日内瓦, University Hospital) http:/expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.html Yeast S. cerevisiae, S. pombe等 (瑞典Goteborg University) http:/yeast-2dpage.gmm.gu.se/ Yeast S. cerevisiae (美国Proteome Inc.) ,Types of Proteomics,Protein Expression Q
16、uantitative study of protein expression between samples that differ by some variable Structural Proteomics Goal is to map out the 3-D structure of proteins and protein complexes Functional Proteomics,蛋白质组学发展历史 - 过去和现在,蛋白质组学发展历史 - 过去和现在,Initiation stage (1994-1997): - Term “proteome” was created by Wilkins and Williams in 1994 - The first meeting on proteome was hold in 1997,Progression
