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1、造血干细胞捐献者血样的 HLA基因定型及资料录入 邓志辉 深圳市输血医学研究所 2005年5月16日,主要工作流程,一、各“工作站”将审核、遴选合格的造血干细胞捐献者血样(贴有骨髓条码),以及捐献者样本清单(捐献者姓名及骨髓编号),一并送达我研究所免疫遗传实验室; 二、免疫遗传实验室对捐献者血样进行HLA-A、B和DRB1基因定型,对送检血样的HLA基因定型结果负责; 三、出具“捐献者HLA基因分型检测结果”报告。,主要内容,(1)捐献者HLA基因定型血样的运输 (2)HLA相关基本概念 (3)HLA分型(定型)技术 HLA血清学分型技术 HLA基因分型技术,捐献者HLA基因定型血样的运输,注
2、意事项: 1、因“登记表”中填写的内容审核不合格血样、以及经HBV等化验检查健康不合格的血样,予以剔除; 2、检查血样管有无破管; 3、路途远、条件许可,可放置适量干冰; 4、由专人运送,防震、防颠覆; 5、合格的HLA基因定型血样与捐献者样本清单一并送往组织配型实验室。,人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA),1958年,Dausset采用白细胞凝集实验,检测出第一个人类白细胞 抗原Mac(A2)。 为高度复杂的遗传多态性系统,每个人的HLA千差万别,即人体生物学的“身份证” , 不同的民族、同一民族不同的地域,HLA基因及单倍型分布有其特点, HLA为人
3、类主要组织相容性系统(MHC),与移植排斥反应密切相关,又称移植抗原。 是机体“识别自身”、“排除异已”的主要遗传标记,参与免疫应答反应。 HLA基因家族位于人类第6号染色体短臂,全长3.6 Mb,HLA基因家族是迄今为止最复杂、多态性最丰富、免疫功能相关基因最集中、与疾病关联最密切的一个区域。,HLA抗原的分类,HLA-I类:由一条具有多态性的多肽链和一条没有多态性的2微球蛋白通过非共价键组成异二聚体。 经典HLA-I类抗原:包括HLA-A、B、C位点抗原,分布于几乎所有有核细胞表面上。如T淋巴细胞、B淋巴细胞等,血小板上吸附HLA-A、B抗原。 非经典HLA-I类抗原:包括HLA-E、G
4、、F位点抗原,抗原在特定时间选择性分布。 HLA-II类:由34KD的 链和29KD的链以非共价键连接而成,包括HLA-DR、DP、DQ抗原; 仅分布于B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞等少数细胞表面。 HLA-类:主要包括补体分子C2、C4及Bf等。,HLA抗原结构,HLA的免疫原性及骨髓库建库工作中 常规检测的HLA位点,HLA是一个高度复杂的遗传多态性系统,如: 经典HLA-I类抗原:HLA-A、B、C位点抗原; 非经典HLA-I类抗原:HLA-E、G 、F位点抗原 HLA-II类:HLA-DR、DP、DQ位点抗原 HLA的免疫原性,主要以HLA-A、B和DRB1的免疫原性较强,因此,骨髓库
5、建库工作中,通常仅对HLA-A、B和DRB1位点进行定型。 无关供者骨髓移植中,NMDP、JMDP有研究资料表明,供/受者对HLA-CW基因的匹配程度,与GVHD、移植成活率相关。,HLA基因,定位于人类第6号染色体短臂(6p21.31),全长3.6 Mb,占人类基因组碱基数的0.1%。 HLA-I类基因:有10个遗传座位,靠近染色体顶端,HLA-A、B、C、E、G、 F为表达基因,H、J、K、L为假基因,无基因产物。 HLA-类基因:靠近染色体着丝粒端,主要包括HLA-DR、DP、DQ基因座。,HLA基因结构,体细胞为二倍体,同源染色体之间相互配对, 每一HLA位点有2个等位基因,一个来自于
6、母亲,另一个来自于父亲。 检测HLA-A、B和DRB1三个位点,有6个等位基因,即6个HLA分型数据。,检出的HLA抗原及等位基因,2003年世界卫生组织(WHO)HLA因子命名委员会命名的HLA等位基因: HLA座位 等位基因 特异性 HLA-A 250 24 HLA-B 490 49 HLA-Cw 119 13 HLA-DRB1 315 17 HLA-DPB1 99 6 HLA-DQB1 53 7 HLA 系统等位基因丰富,每个人的等位基因型千差万别,可以说在随机人群中,难以有完全相同的。,HLA的命名,1、血清学命名:遗传位点后用数字表示,如A1、A2、A3、B5等。 以大写字母A、B、
7、C表示HLA的遗传座位;HLA特异性以数字表示;除HLA-A、B位点抗原的特异性的命名数字不重复外,其它位点抗原连续独立命名;C位点抗原以Cw为字首命名,以和补体系统区别。 2、HLA等位基因命名原则:位点后加“*”,再加数字表示。如DRB4*01 03 1 02 N 第1、2位数表示HLA抗原的特异性,第3、4位数表示等位基因(亚型),结尾加N表示无效等位基因或不表达基因。 HLA等位基因所对应的血清学特异性,可查阅过WHO公布的HLA字典。 HLA低分辨水平基因定型:确定HLA基因前2位数。 HLA高分辨水平基因定型:确定HLA基因第4位以后的数字。,HLA的生物学功能,HLA参与免疫应答
8、反应,与抗原肽结合形成HLA-抗原肽复合物,抗原提呈细胞将此复合物交由T淋巴细胞处理,T细胞上的T细胞受体(TCR)能够对抗原提呈细胞上的HLA-抗原肽复合物产生双识别,从而介导免疫反应。,T细胞受体对HLA-抗原肽复合物的 双识别作用,人类白细胞抗原(HLA)的应用,HLA分型在骨髓和器官移植组织型 法医学亲子鉴定和个体识别 人类种群学 安全输血 疾病相关联的研究等领域(如HLA-B27),HLA分型技术,1、传统的血清学和细胞学分型方法 因需要有活性的细胞、定型血清或分型细胞来源困难、分型准确性较差等原因,已逐步被淘汰。 2、PCR为基础的HLA基因分型技术 分型所需要的血样量少,不需要有
9、活性的细胞,实验重复性好、结果的准确性高,易于质控和准标化。HLA基因分型技术取代了血清学方法。 当前的“中国造血干细胞捐献者资料库”的建库技术,不同于以往的“中华骨髓库”。前者采用基因定型技术检测HLA-A、B、DRB1基因,后者采用血清学方法检测HLA-A、B抗原。,“中国造血干细胞捐献者资料库”对捐献者血样HLA基因分型技术的要求,对HLA-A、B和DRB1进行基因分型,分辨率达低分辨水平。 结果既报告每一样本的基因型,同时报告对应的特异性。 通过各省级组织配型实验室室内质控,以及国家“HLA质控实验室”组织的室间质控对HLA基因分型的准确性进行质量监控。,HLA基因分型技术,PCR-序
10、列特异性引物(PCR-SSP) PCR-SSO流式磁珠分析 HLA测序分型(SBT) PCR-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP) 基因芯片技术 参比链介导的构象分析(RSCA) HLA单倍体基因测序,HLA基因分型的步骤,1、DNA提取 2、PCR扩增 3、PCR扩增产物的检测 4、结果分析(判别受检者HLA基因型) 5、HLA基因定型报告,PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)分型技术,基本原理: 使用序列特异性引物(SSP) 特异性扩增HLA等位基因,电泳 分离PCR扩增产物,根据是否存 在PCR产物以及片段大小,确定 相应基因。 主要步骤: 1、DNA提取 2、PCR扩增 3、
11、琼脂糖凝胶电泳检测 4、结果分析,PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)分型技术,PCR-序列特异性引物 (PCR-SSP)分型技术,特点:简便、快速、直观等,特别适合于尸肾移植的组织配型;所需设备简单,易于开展;为常规采用的经典HLA基因分型技术。 应用:适合于经典HLA-、类分子的基因分型 分辨率:低分辩、高分辩基因分型水平。,PCR-SSO流式磁珠分析技术,基本原理:以反向核酸杂交为基础,杂交产物采用流式磁珠仪进行自动检测,为高通量HLA基因定型技术。,PCR-SSO流式磁珠分析技术的特点(一),实验原理、引物设计、扩增产物的检测等,与SSP分型技术不同。 PCR扩增反应结束后,将标记
12、探针的磁珠直接加入PCR产物中,微量离心管(反应板)置于PCR扩增仪上进行分子杂交; 杂交产物用流式磁珠仪进行自动进样检测,用HLA分析软件确定HLA基因型。,流式磁珠分析技术的特点(二),配合DNA全自动DNA提取仪及多个PCR基因扩增仪,具有高通量、操作简便、快速特点。适合骨髓库、脐血库大批量样本的HLA基因分型工作。 基于流式磁珠分析技术,已有多家商品化、低分辩水平的HLA基因分型试剂盒。 可用于HLA-A、B、C、DRB1和DQB1座位的基因分型。,HLA测序分型(SBT)技术,HLA测序分型(SBT)技术,国际公认的HLA基因分型方法,高分辨率、高精度; HLA测序分型技术较复杂,受
13、实验室设备条件、试剂价格的限制,以往能够开展HLA测序分型的实验室尚不多; 随着非血缘关系造血干细胞移植供/受者对HLA高分辩确认实验,以及人类学研究、HLA与疾病相关联等领域的需要,SBT技术的开展已日益增多。,HLA测序分型(SBT)技术,可在同一PCR反应条件 、同一测序反应的条件下, 对不同HLA座位进行同步 扩增,简化了实验操作; 随着毛细管电泳基因测 序仪及新的HLA分析软件 的应用,HLA测序分型处 理样本的能力逐步高通量 化。,HLA基因分型技术的展望,HLA基因分型技术呈现多元化趋势,HLA基因分型涵盖面不断扩大; 低分辩、中分辩向高分辩水平发展; 分型结果的准确性和精确度不
14、断提高; 实验操作更为简便快速; 不同的HLA分型技术,其实验原理、优缺点不同,因而各实验室可根据自身的目的、需要并结合自身的技术工作平台,加以选择应用。,谢谢!,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考,实际情况实际分析,主要经营:课件设计,文档制作,网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户,做到让客户满意! 致力于数据挖掘,合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面,打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,