毕赤酵母表达手册.pdf

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2、 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述：综述： 基本特征：基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译 后修饰等。不仅如此，操作时与 E.coli 及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织 培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有 与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。 这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术：与

3、酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化 基因置换 基因破坏 另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。 例如：HIS4 基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野 生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如 HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3 等基因 在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧 化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要 在一个特殊的细胞器过氧化物酶体里进行， 使

4、得有毒的副产物远离细胞其余组分。 由于 醇氧化酶与 O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化 物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白：两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶AOX1 及 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是 AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性 蛋白的 30%以上。AOX1 基因已被分离，含 AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白 的目的基因的表达。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因 的菌株比带

5、AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 表达：表达： AOX1 基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有 5%的 polyA+ RNA 来自 AOX1 基因。AOX1 基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含 葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推 荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使 AOX1 基因达 到最低水平的表达，诱导物甲醇是 AOX1 基因可辨表达水平所必需的。 AOX1 突变表型：突变表型： 缺失 AOX1 基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生

6、一种表型为 Muts 的突变株 （methanol utilization slow） ，过去称为 Mut，而 Muts 可更精确地描述突变子的表型。结果 细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus） 指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。 这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的 整合方式。 蛋白胞内及分泌表达：蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。 分泌表达需要蛋白上的信号肽序列， 将 外源蛋白靶向分泌通路。 几种不同的分泌信号序列已被成功应用， 包括几种外源蛋白本身分 PDF created

7、 with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 泌信号序列，利用酿酒酵母 因子前原肽信号序列也获得许多成功。 分泌表达外源蛋白的最大优点是：分泌表达外源蛋白的最大优点是：毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最 小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成 份，也可算作蛋白纯化的第一步。注意，如果外源蛋白一级结构中有可识别的糖基化位点 （Asn- X- Ser/Thr）,则这些位点可能发生糖基化。 翻译后修饰：翻译后修饰： 与酿酒酵母相比，毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有优势，因为不会使其过

8、糖基化。 酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N- 连接糖基化高甘露糖型，然而毕赤酵母中蛋白转录后所增 加的寡糖链长度（平均每个支链 8- 14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50- 150 个甘露糖残 基）短得多。 另外，酿酒酵母核心寡糖有末端 - 1,3 聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为酿酒 酵母中糖基化蛋白的 - 1,3 聚糖接头与蛋白的超抗原性有关， 使得这些蛋白不适于治疗应用。 虽然未经证明， 但这对毕赤酵母产生的糖蛋白不构成问题， 因为毕赤酵母表达蛋白与高级真 核生物糖蛋白结构相似。 选择载体用于基因多拷贝整合：选择载体用于基因多拷贝整合： 在某些情况下， 毕赤酵母中重组基因多拷贝整

9、合可增加所需蛋白的表达量。 该试剂盒中 的三个载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插 入， 同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。 体内整合可通过高遗传霉素抗 性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。pPIC3.5K, pAO815 用于胞内表达，而 pPIC9K 用于分泌表达，所有载体均利用 AOX1 启动子来诱导高 水平表达。 多拷贝插入频率：多拷贝插入频率： 毕赤酵母 His+转化子高拷贝整合事件自发发生的概率为 110%，体内方法可筛选可能 插入多拷贝外源基因的 His+转化子， 体外方法

10、可通过连接构建多拷贝子。 当选择 His+转化子 时，它们中插入体外构建结构多聚体的概率很高。 体内多拷贝插入的产生：体内多拷贝插入的产生： Ppic3.5k 及 Ppic9k 含有细菌 kan 基因，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，注意 Kan 并不赋 予毕赤酵母卡那霉素抗性。遗传霉素抗性水平主要依赖整合的 kan 基因的数目。单拷贝 Ppic3.5k 或 Ppic9k 整合入毕赤酵母基因组后， 赋予毕赤酵母约 0.25mg/ml 的遗传霉素抗性水 平。 任何载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平， 从 0.5mg/ml （1- 2 拷贝） 到 4mg/ml （7- 12 拷贝） 。由于 kan 基

11、因与表达盒（pAOX1 及目的基因）之间有遗传连锁，可从遗传霉素高抗 性推断该克隆所包含多拷贝目的基因数。由于基因的剂量效益，蛋白的表达可能会增加。因 此，kan 基因可检测转化子是否含有多拷贝目的基因。下图显示多拷贝插入及 kan 基因与表 达盒的连锁。 PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 遗传霉素直接选择：遗传霉素直接选择： 在酵母中对遗传霉素抗性进行直接选择并不十分有效， 因为新转化的细胞需要时间表达 足够量的抗性因子。 由于酵母生长比细菌慢得多， 大部分重组酵母在积累足够多的抗性因子 以

12、抵抗平板上抗生素之前就已经被杀死了。 最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序 需要先对 HIS转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。 虽然可以用电泳进行直接筛选， 但用在遗传霉素筛选之后再进行电泳筛选， 获得含高拷 贝克隆的机会更大，大约可获得 5- 9 拷贝的克隆，而直接电泳选择只能获得平均为 1- 3 拷贝 的克隆。原生质转化时不能用遗传霉素直接选择。 体外多拷贝插入的产生：体外多拷贝插入的产生： 下图显示如何产生多表达盒插入载体以转化毕赤酵母。目的基因插入独个 EcoRI 位点 后，产生的表达盒（pAOX1 及目的基因）上下游侧翼分别为独个的 BglII 及 BamHI 位

13、点。 含目的基因的 pAOX815 用 BglII 及 BamHI 消化以分离表达盒，表达盒再插入 BamHI 位点以产生串联重复表达盒，重复该插入程序可产生一系列含单个 HIS4 基因及逐渐增加数 目表达盒的载体。 用体外形成的多拷贝子转化毕赤酵母增加了多拷贝表达盒重组子出现的频率， 可设计包 含一特定数目多拷贝插入的毕赤酵母重组子。 转化及整合：转化及整合： 可产生两个不同表型的 His+重组菌株：质粒 DNA 线性化位置不同，转化 GS115 后可 产生两种转化子 His+Mut+及 His+Muts。KM71 只产生 His+Muts，因为该菌株为 Muts 表型。 两种重组子Mut及

14、 Muts都是有用的， 因为一个表型可能比另一个表型更有利于蛋白表达。 理想条件下，每一个表型应该检测 6- 10 个重组子。没有办法预测哪个结构或克隆更利于蛋 白表达。强烈推荐用 PCR 分析重组子来证实整合情况。 成功将基因构建至 AOX1 启动子下游后，线性化质粒转化毕赤酵母时激发重组。下图 显示用不同酶消化时产生何种重组子。 限制酶 插入事件 GS115 表型 KM71 表型 SalI 或 StuI 插入 his4 His+Mut+ His+Muts SacI 插入 5AOX1 His+Mut+ His+Muts BglII 取代 AOX1 His+Muts His+Muts（不推荐）

15、 PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 表达及扩大培养：表达及扩大培养： 用 PCR 证实毕赤酵母重组后，可检测 His+Mut+及 His+Muts 的表达。小规模培养每个 重组子，用甲醇诱导，检测时间点.如果是胞内表达，每个时间点细胞沉淀用 SDS- PAGE 分 析;如果是分泌表达，分析每个时间点的细胞及上清。如果有蛋白的抗体，推荐既用考马斯 亮蓝染色又用 western blot 分析 SDS- PAGE 凝胶。如果可以,建议检测蛋白活性。因为并不是 所有蛋白都能达到 g/l 的水平，所以

16、建议进行 western blot 或活性分析，不要仅做 SDS- PAGE 考马斯亮蓝染色分析。 如何选择最佳的表达蛋白毕赤酵母菌株及优化诱导见 P49- 50。如表达已达最优，大规 模表达以产生更多蛋白。 PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 方法方法 毕赤菌株表型：毕赤菌株表型： 毕赤酵母菌 GS115 及 KM71 在组氨酸脱氢酶位点 （His4） 有突变,因而不能合成组氨酸， 所有表达质粒都有 HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。 GS115 及 KM71 自发回复突变到 His原养生物机率小于 1/108。 KM71 的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中 不能生长。用野生型 ARG4 基因破坏 AOX1 基因后，产生