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1、精品 毕业论文（设计）毕业论文（设计） Bachelors Thesis 论文题目精氨酸激酶（精氨酸激酶（AK）的提取与纯化）的提取与纯化 作者姓名 指导教师 所在院系生物系 专业名称生物科学 完成时间年 6 月 6 日 精品 主主 要要 符符 号号 对对 照照 表表 AK 精氨酸激酶 E.coli 大肠杆菌 IPTG 异丙基硫代-D-半乳糖苷 Kanamycin 卡拉霉素 CMC CM-Cellulose S-100 SephacrylTM-100 2-mercaptoethanol 巯基乙醇 Glycine 甘氨酸 PMSF 苯甲基磺酰氟 EDTA 乙二胺四乙酸 NaN3 迭氮钠 Arg
2、精氨酸 ADP 二磷酸腺苷 ATP 三磷酸腺苷 h 小时 min 分钟 精品 目目 录录 1 引言 .1 1.1 精氨酸激酶（AK） .1 1.2 蛋白质的分离与纯化 .2 2 实验试剂以及实验仪器： .5 2.1 实验材料 .5 2.2 主要实验试剂与仪器 .8 3 实验方法 .9 3.1 活化菌种 .9 3.2 扩大培养 .9 3.3 IPTG 诱导 AK 基因的表达 .9 3.4 蛋白质提取.9 3.5 蛋白质的检测 .10 3.6 蛋白质的纯化 .10 4 结果与分析 .12 4.1 AK 诱导表达电泳图 .12 4.2 蛋白质经 CMC 离子交换的层析谱图和电泳图.13 4.3 蛋白
3、质经分子筛 S-100 交换的层析谱图和电泳图 .14 4.4 蛋白质经 QSEPHAROSE阳离子交换的层析谱图和电泳图 .16 4.5 AK 经各步纯化后的 SDS-PAGE 电泳图谱.17 5 讨论 .18 参考文献： .20 精品 精氨酸激酶（精氨酸激酶（AK）的提取与纯化）的提取与纯化 摘要摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶 EC2.7.3.3）存在 无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。重组有 AK 基因的 E. coli Rosetta，在含有 50 g/ml 的卡纳霉素的 LB 培养基中培养。当 A600达到 0.6-0.8 时，用终浓度为 0.2 mM 的异丙基
4、硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养 3 小时。 加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提 液。通过 CM-Cellulose 阳离子交换层析，SephacrylTM-100 凝胶过滤层析，Q-Sepharose 阴离子交换层析分离纯化得到 电泳纯的精氨酸激酶。 关键词关键词：精氨酸激酶 提取与纯化 精品 Extraction and Purification of Arginine Kinase Abstract： Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3） ，plays an important r
5、ole in cellular energy metabolism in invertebrate. E. coli Rosetta which contains recombinant AK gene was grown in LB medium containing kanamycin (Final concentration: 25 g/mL). When absorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropyl -D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the i
6、ncubation was continued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, then the crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified by following three methods in turn: CM- Cellulose positive ion exchange chromatography, SephacrylTM-100gel filtrate chromatography, and Q- Sepharose
7、anion exchange chromatography. A purified AK was found to be homogenous by SDS poly - acrylaminde gel electrophoresis. Key words: arginine kinase extraction and purification 精品 精氨酸激酶（精氨酸激酶（AK） 的提取与纯化的提取与纯化 1 引言 1.1 精氨酸激酶（AK） 精氨酸激酶1（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸 化的胍基化合物。AK 在体内催化如下反应： Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Argin
8、ine phosphate AK 广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物 包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、 海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到 AK。 虽然 AK 在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相 同，但不同来源的 AK 在结构上表现出了非常大的多样性。按照 蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基 AK，如海湾对虾中 Penaeus aztecrs 中提取的 AK，相对分子量约 为 40KD，单亚基 AK 是目前研究最广泛的，本实验中我们所研 究的 AK 就是单亚基，相对分子量为 40KD。2.海参 Stichopusjap
9、onicus 中提取的 AK 为双亚基的蛋白质，相对分子质 量约为 84KD。3.环节动物 Sabellapavonina 中的 AK 具有四个亚 基，分子量为 150-160KD。 某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK 是 由一个小的 螺旋组成的 N 端结构域和一个大的 C 端结构域组成 精品 的，C 端结构域与 Glu 合成酶的 C 端结构域相似，8 股串起来的 反平行 折叠被 7 个 螺旋所包绕2。过渡态类似物的结合部位 不在两个结构域之间，而是在 C 端结构域的内部3。如下图所示 4： 图图 1. 结合有过渡态类似物的结合有过渡态类似物的 AK 的晶体结构的晶体结构 我们
10、已经克隆有精氨酸激酶基因的菌株，宿主菌含表达质粒 pET28a, pET28a 含：强启动子序列，两个 lac 操纵序列；精氨酸 激酶基因，核糖体结合位点，多克隆位点，复制起点。 在工程菌株中，导入抗 Kana 青霉素的 pET28a 质粒，菌株中 原有质粒产生阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与 pET28a 的 LacO 操纵基 因结合，阻止外源基因的表达。当加入 IPTG 诱导时，IPTG 与阻 遏蛋白结合，解除了阻遏蛋白与 pET28a 操纵基因结合的抑制作 用，使 pET28a 上面的外源基因能够顺利表达5。IPTG 是一种乳 糖类似物，我们的主要目的是诱导表达并纯化精氨酸激酶，为后 续研究其在
11、蛋白质折叠和分子伴侣中的功能做准备 1.2 蛋白质的分离与纯化 1.2.1 细胞的破碎 精品 1)高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积， 盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所 需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2)玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆 来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高 速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3)超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细 胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各 种酶，常选用 50-100 毫克菌体/毫升浓度，在 1K
12、G 至 10KG 频率 下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热， 应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 4)反复冻融法：将细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复几 次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀， 使细胞结构破碎。 5)化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷 基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚， 可采用溶菌酶处理效果更好。 1.2.2 蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与 脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此， 可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋
13、白质及酶。 1.2.3 蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： 1.2.3.1 根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1)蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随 着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续 升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称 盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水 精品 化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶 粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液 pH 在蛋白质等电点则效果更 好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需 的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可 使各种蛋白质分段沉淀。 2)等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度 也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的 pH 达 到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐 析法结合用。 3)低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋 白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变 性，应在低
