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1、齐 齐 哈 尔 大 学 毕毕 业业 论论 文文 题 目： 克东腐乳发酵生产中优势菌株 细胞融合方法初探 学 生 姓 名： 专 业 班 级： 指 导 教 师： 齐齐哈尔大学毕业论文齐齐哈尔大学毕业论文 I 摘 要 本文以克东腐乳中藤黄微球菌（micrococcusluteus）QSY 和 QSG 为研究对象，以青 霉素（Penicillin）、链霉素（Streptomycin）和红霉素（Erythromycin）、白霉素 （Kitasamycin）、卡那霉素（Kanamycin）、氯霉素（Chloromycetin）、庆大霉素 （Gentamicin）、螺旋霉素（Spiramycin）、土霉素（
2、Terramycin）和利福平 （Rifampicin）10 种抗生素分别作为两株菌的抗性标记。又分别从溶菌酶浓度、酶解时 间、酶解温度、酶解 pH 值对这两株菌原生质体形成和再生的影响进行了初步探索。 实验结果表明：40g/mL 的青霉素和 140g/mL 的链霉素可作为两株菌的抗性标记。 在相同条件下，QSG 菌株的最适溶菌酶浓度为 3mg/mL，酶解时间为 60min，酶解温度 为 37，酶解 pH 值 6.5；QSY 菌株的最适溶菌酶浓度为 2mg/mL；酶解时间为 30min，酶解温度为 34，酶解 pH 值为 6.5. 关键词：藤黄微球菌 抗性标记 原生质体 溶菌酶 齐齐哈尔大学毕
3、业论文齐齐哈尔大学毕业论文 II Abstract This article take the Kedong fermented bean curd in garcinia hanburrii micrococcus (micrococcusluteus)QSY and QSG as the object of study, by penicillin (Penicillin), chain mildew element (Streptomycin) and erythromycin (Erythromycin), albomycin (Kitasamycin), card that mild
4、ew element (Kanamycin), chloromycetin (Chloromycetin), celebrates magnamycin (Gentamicin), spiral mildew element (Spiramycin), terramycin (Terramycin) and rifampin (Rifampicin)10 plants the antibiotic to take two fungi separately the resistant marks.Also from the bacteriolysin density, the enzymolys
5、is time, the enzymolysis temperature, the enzymolysis pH value formed separately to these two fungus protoplast with the regeneration influence has carried on the preliminary exploration. The experimental result indicated that,40g/mL penicillin and 140g/mL the chain mildew element may take two fungi
6、 the resistant marks.Under the same condition, the QSG strain most suitable bacteriolysin density is 3mg/mL, the enzymolysis time is 60min, the enzymolysis temperature is 37, enzymolysis pH value 6.5; The QSY strain most suitable bacteriolysin density is 2mg/mL; The enzymolysis time is 30min, the en
7、zymolysis temperature is 34, the enzymolysis pH value is 6.5. Key word: Garcinia hanburrii micrococcus Resistant mark Protoplast Bacteriolysin 目 录 摘 要 AbstractAbstract 第 1 章 绪论 1 1.1 课题背景 1 1.1.1 克东腐乳特点 1.2 研究近况 5 1.2.1 国内研究近况 5 1.2.2 国外研究近况 5 1.3 本文研究内容6 第 2 章 材料与方法7 2.1 材料7 2.1.1 原料 7 2.1.2 试剂 7 2
8、.1.3 仪器设备8 2.1.4 主要溶液的配制 9 2.1.5 培养基的配制 13 2.2 方法 14 2.2.1 生长曲线测定14 2.2.2 抗药性标记15 2.2.3 原生质体制备条件优化15 2.2.4 16 2.2.5 17 2.2.6 18 2.2.7 18 2.2.8 19 2.2.9 19 2.2.10 21 第 3 章 结果与讨论 23 3.1 生长曲线测定及细菌培养 23 3.2 抗药性标记结果 27 3.3 原生质体制备条件的优化结果 结论 38 参考文献 39 附录 41 致谢 49 齐齐哈尔大学毕业论文齐齐哈尔大学毕业论文 1 第 1 章 绪 论 1.1 课题背景
9、腐乳是我国的传统豆制发酵食品在我国有 1000 多年的历史。它是一种利用微生 物法改变植物蛋白风味的植物奶酪食品，又称为大豆干酪。克东腐乳是以藤黄微球菌 为主要生产菌株，在其长达 180 天的生产过程中，产品中的蛋白质在藤黄微球菌及其 他酶类作用下，逐步转化为氨基酸，在一些其他成分的配合下，产生腐乳特有的芳香， 使人食欲、胃口大开。克东腐乳生产工艺独特，产品远销东南亚、日本、美国、港澳 地区。产品亦有健脾补阳、温中散寒、解膻去腻、帮助消化等功能，是国内唯一特许 的中草药配方的腐乳。 利用细菌进行发酵，具有资源广泛，生长繁殖快，培养方法简单，可利用廉价原 料通过发酵进行大规模的工业化生产，并且便
10、于自动化控制等诸多优点。 本文主要目的是将克东腐乳中的两种藤黄微球菌进行原生质体融合，利用新菌种 对腐乳进行发酵，达到更好的效果。 1.1.1 克东腐乳特点 国内只有黑龙江克东腐乳等少数厂家利用细菌发酵细菌型腐乳。细菌型特点为前 期发酵使用细菌 ，根据生产用菌可分为微球菌腐乳和枯草杆菌腐乳。微球菌腐乳多采 用藤黄微球菌作为发酵菌种。克东腐乳是国内唯一一家采用藤黄微球菌技术酿造的腐 乳。其腐乳特点是前后酿造两次需要 180d，所以味道醇厚，后味绵长，营养丰富。 1.2研究近况 1.2.1 国内研究现状 腐乳在我国已有一千多年的历史，其制作工艺及产品风味各具地方特色，是一种 非常大众化的食品。近年
11、来，腐乳以其品种多样、风味独特、滋味鲜美、营养丰富、 价格低廉，越来越受到国内外广大消费者的关注和喜爱，也吸引了更多科研工作者的 目光，目前在国内已有大量科学工作者致力于腐乳优良菌株的筛选和新工艺的开发， 使腐乳这种传统食品的质量进一步得到提升4。然而，作为一种佐餐调味品，人们对于 腐乳的认识大多仍停留在它含有蛋白质、脂肪酸、微量元素以及维生素等多种基本营 养成分方面，对其含有大量生物活性物质以及具有保健作用的深层次方面知之甚少。 近年来，随着大豆及大豆制品的生物活性物质和保健作用逐渐成为研究的热点，在腐 乳的研究上，也出现了一些相关的报道。 目前，国内外许多重要的抗生素都是通过原生质体融合技
12、术来提高其产量的。例 如生二素链霉菌通过原生质体融合使螺旋霉素的产量提高了 2 倍；陈五岭等通过比较 齐齐哈尔大学毕业论文齐齐哈尔大学毕业论文 2 He-Ne 激光和聚乙二醇对红霉素链霉菌和龟裂链霉菌灭活原生质体的诱导融合，筛选 得到几株红霉素产量与亲本相比有明显差异的融合子，产抗生素能力最高提高了 78.24%； 王金盛等以小诺霉素产生菌棘孢小单孢菌为出发菌株，通过单亲致死原生质体融合， 筛选得到 4 株小诺霉素含量高于亲株的融合子。浙江郑晓冬等人将具有分泌型细胞膜 的枯草杆菌与谷氨酸产生菌（黄色短杆菌）进行细胞融合，要获得细胞透性优于黄色 短杆菌的融合子，以便解除谷氨酸对关键酶的反馈抑制，
13、从而提高了谷氨酸产率。 1.2.2 国外研究现状 由于传统大豆制品具有独特的豆腥味,一度不被西方发达国家居民普遍接受,生产 和消费都较少。然而近年来,随着大豆育种技术和食物生产水平的提高,无豆腥味大豆 制品得到普遍发展,加上传统大豆制品食用方便,含有丰富的蛋白质和钙,并且其中也富 含大豆中的特殊功能保健因子,因此传统大豆制品如豆腐、腐乳等也受到西方发达国家 居民的广泛欢迎,消费量在逐年升高。80 年代,美国的研究人员就开始对腐乳进行了研 究。日本安田小组筛选到一株豆乳蛋白凝乳酶活力高的芽孢杆菌并对其进行全面的酶学 研究后,采用基因工程的方法获得了高产稳定的大量凝乳酶生产菌株,从而将腐乳的研 究深入到了分子生物学的水平。 自从 1979 年匈牙利的 Pesti 首先利用微生物原生质体融合技术提高青霉素产量以 来，开创了原生质体融合技术在实际工作中的应用。例如日本味之素公司应用细胞融 合技术使产生氨基酸的短杆菌杂交，获得比原产量高 3 倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高 产新菌株 然而目前为止国外对腐乳中菌类的研究依然比较少，大部分研究都集中在生产工 艺的改进上。 1.3 本文研究内容 1.藤黄微球菌黄菌、绿菌生长曲线测定； 2.抗生素抗性标记的筛选: 将青霉素（Penicill
