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1、目 录 英文缩写对照表1中文摘要2英文摘要41 前言62 材料62.1 主要仪器设备62.2 实验动物72.3 样品与试剂82.4 常用工作液83 方法93.1 CP的制备93.1.1 粗提法93.1.2 高效液相色谱分离纯化 103.2 CP的理化性质鉴定 103.2.1 37 OC凝结试验 113.2.2 紫外吸收值测定 113.2.3 氨基酸组成和含量分析 113.2.4 蛋白质浓度测定 113.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳123.2.6 RP-HPLC分析CP 123.2.7 生物安全性实验 133.3 CP防止UVA氧化损伤实验143.3.1 L929细胞的培养、冻存与复苏143
2、.3.2 UVA对L929细胞活性的影响 143.3.3 CP对细胞UVA氧化损伤的保护作用144 结果 164.1 CP的制备 164.2 CP的理化性质鉴定 164.2.1 37 OC凝结试验 164.2.2 紫外吸收值测定 164.2.3 CP氨基酸组成和含量分析 174.2.4 蛋白质浓度测定 184.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳194.2.6 RP-HPLC分析CP194.2.7 生物安全性试验 204.3 CP防止UVA氧化损伤实验 224.3.1 UVA对L929细胞活性的影响 224.3.2 CP对细胞UVA氧化损伤的保护作用 225、讨论255.1 CP的制备 255.1
3、.1 提高CP得率的因素255.1.2 提高CP纯度的因素265.1.3 高效液相色谱是分离纯化CP的有效途径 275.2 CP的理化性质鉴定 275.2.1 CP在223nm处有紫外最大吸收值 275.2.2 CP氨基酸组成及含量分析 275.2.3 SDS-PAGE鉴定285.2.4 RP-HPLC分析CP 285.2.5 CP具有生物安全性 285.3 CP防止UVA氧化损伤研究 295.3.1 UVA对成纤维细胞有活性有抑制作用 295.3.2 CP能够降低UVA氧化损伤的细胞MDA活性 305.3.3 CP能够提高UVA氧化损伤细胞的GSH-px活性 30小结 31参考文献 32文献
4、综述 胶原蛋白的研究进展 37致谢 46英文缩写对照表英文缩写英文名称中文名称CPCollagen protein型胶原蛋白A Absorbance吸光值BPBBromophenol blue溴酚蓝ddH2O Double distilled water双蒸水PBS Phosphate buffered saline磷酸盐缓冲液SDS-PAGESDS-polyacrylamidegel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSSodium dodecyl sulfate十二烷基磺酸钠TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane 三（羟甲基）氨基甲烷TEM
5、EDN,N,NN-tetra methylethylene diamineN,N,NN-四甲基乙二胺DMSODimethyl sulphoxide 二甲基亚砜CBBCoomassie Brillant Blue考马斯亮蓝MTT 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5 -diphenyl tetrazolium bromide噻唑蓝HPLCHigh performance liquid chromatography高效液相色谱UVAUltraviolet radiation A长波紫外线MDAMalondialdehyde丙二醛GSH-pxGlutathione pe
6、roxidase谷胱甘肽过氧化物酶 型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究学科专业：动 物 学 研究方向：生化制药 指导教师： 教授 研 究 生：（2001345） 内 容 摘 要本文围绕型胶原蛋白（CP）的制备及其理化性质进行研究，同时在其防止长波紫外线（UVA）对细胞的氧化损伤方面进行了初步探索，为CP的进一步研发提供理论基础和科学依据。以猪皮为材料，比较酸溶法、酶解法、中性盐溶液法三种粗提方法，选择得率和纯度都较高的酶解法为最佳粗提法，结合高效液相色谱进行CP的分离纯化。CP理化性质鉴定结果表明：样品在223 nm处有紫外最大吸收值；含有十八种氨基酸，氨基酸总量在90%
7、以上；样品的蛋白质浓度为1.03mg/ml；SDS-PAGE测定CP由、三条链组成；色谱分析纯度约为100%。通过小鼠急性毒性试验、豚鼠致敏试验、细胞毒性试验对自制CP进行整体水平和细胞水平的生物安全性评价，观察期内，小鼠未见异常毒性反应；豚鼠注射点无红斑及水肿情况；细胞毒性小于级，结果证明本方法制备的CP无毒副作用。评价CP对UVA氧化损伤的L929细胞的保护作用。结果表明：随着UVA照射时间的延长，细胞的活性明显降低，说明UVA对细胞的氧化损伤是明显的，其中表现为MDA的含量升高、GSH-px的含量降低。加入不同浓度的CP后照射同样的时间，MDA的含量有所下降、GSH-px的含量有所升高，
8、其中50%CP组的效果极为显著（P0.01）。提示该物质有防止UVA氧化损伤的作用。综上所述，利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从猪皮中分离纯化CP，该方法具有高效性，高选择性和易放大性；理化性质鉴定及生物安全性试验表明，该物质为纯活性胶原蛋白，无毒副作用；同时对体外细胞的UVA氧化损伤具有较好的保护作用。关键词：型胶原蛋白；高效液相色谱；制备；鉴定；氧化损伤Studies on the preparation，identification of CPand its protective effect on cells damaged by UVAMajor : Biology Spe
9、ciality : Zoology Tutor : Prof. Wei Hong Author : Wang Lin（2001345）AbstractIn this paper,how to prepare CPand identify physico-chemical property had been studied, and UVA oxidative damage L929 was perliminary discussed. These datas provided theoretic foundation and scientific proof for further resea
10、rch and development of this product.Pigskin was used as material. According to the comparation among the three kinds of crude extraction methods including acid dissolve,enzymolysis and neutral salt solution. The method of enzymolysis combined with HPLC was chosen to prepare CP.The physico-chemical property of CPwas identified. The results showed that: CPshowed character absorption peak at 223nm; CPhad 18 kinds of amino acids, total count of amino acid was more than 90%; the concentration of protein was 1.03 mg/ml; CPwas composed
