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1、中国人民解放军第三0二医院 王海滨写在课前的话荧光定量PCR质量一般有三个要素,分别是试剂、仪器和人员,另外还有内标的影响。对荧光定量PCR的影响因素较多,因此要得出比较准确、稳定性的PCR结果,需要对各个环节进行严格控制。荧光定量PCR质量的影响因素有哪些？一、荧光定量PCR质量的三个要素荧光定量 PCR 质量一般有三个要素，分别是试剂、仪器和人员。试剂是由生产厂家专门提供，包括核酸提取与扩增两个部分。核酸提取是由不同单位的工作人员进行操作，扩增部分是由厂家专门制备好的。仪器包括三个方面：温控、光学和软件，不同仪器温控、光学、软件三个部分原理和性能均有一定差异。不同单位人员的专业知识和管理方
2、式方法不同，对检测结果也有明显的影响。另外还有内标的影响。 荧光定量PCR质量的影响因素有（ ）窗体顶端A. 试剂B. 仪器和人员C. 内标D. 以上均有窗体底端A. 试剂B. 仪器和人员C. 内标D. 以上均有正确答案：D解析：荧光定量PCR质量的影响因素有试剂、仪器和人员和内标。试剂包括核酸提取与扩增两个部分，核酸提取是由不同单位的工作人员进行操作，涉及环节较多。不同仪器温控、光学、软件三个部分原理和性能均有一定差异。不同单位人员的专业知识和管理方式方法不同，对检测结果也有明显的影响。不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果有何影响？二、不同核酸提取方法对荧光 PCR 定量结果的影响 目前临床
3、常用的核酸提取方法有：一是聚乙二醇法，也称煮沸法；二是层析柱法，也称为提纯法；第三是磁珠法，也称吸附法。第四是近年出现的血清或血浆的检测标本直接加入方法。第五是近年罗氏公司引进的 COBAS TaqMan 全自动核酸提取与扩增系统，其提取原理是磁珠法。 (一) 聚乙二醇法 1 、操作步骤 取 100 微升配置好的聚乙二醇工作液，需注意目前所用的聚乙二醇一般是 20% 的聚乙二醇，较黏稠，试剂盒保存温度为 -20 度，因此在温室要彻底的复溶，溶化呈液状。加样时吸 100 微升，因为黏稠，一定要过吸、停顿，然后把吸头外多余的聚乙二醇粘掉，再加到相应的操作管中。吸和加均注意停顿，加入到操作管里面的含
4、量应该尽量精确至 100 微升。由于液体的黏稠，不同的人、不同的操作手法差异特别大。加好 100 微升的聚乙二醇后加入 100 微升待测标本，主要包括血清、血浆或其他液体，二者要彻底混匀。第二步是 13000 转离心，一般用角度离心机离心 10 分钟，弃掉上清液，尽可能少留残余，并保证不把沉淀物吸掉，沉淀物含有核酸成分。第三步加入碱性裂解液 25 微升，碱性裂解液往往带有悬浮物，充分混匀。含有核酸的沉淀物往往比较黏稠，加上碱性裂解液通过振荡混匀常常不会把沉淀物振开，而如果通过吹打混匀，又容易把沉淀物带走一部分。此操作环节建议操作人员咨询实际生产厂家，因为试剂盒标准品不通过核酸提取，如果这一步标
5、本的核酸丢失过多，而外标标准又无变化，对结果的影响较大，是振荡混匀或者吹打混匀，要求操作人员和厂家达成共识。最后一步是100度煮沸 10 分钟，后 13000 转离心 10 分钟。取上清液进行 PCR 检测。 2 、优缺点 优点是操作较快速，可部分去除标本中的 PCR 干扰物质（胆红素、血脂、离子等）。缺点是核酸丢失严重。弃掉的上清液含有大量 HBV （ 50% 左右）；碱性裂解液核酸裂解不彻底，与混匀程度密切相关（丢失 30% 左右）。操作步骤较多,每个环节均存在不同实验室人员和仪器的差异，因此影响因素较多。 （二）层析柱法 1 、操作步骤 层析柱方法主要用于 RNA 的提取，以 QIaGe
6、n 试剂为例做简单的分析。它分为四个步骤：第一步是取 560 微升已配置好的核酸裂解液，与 140 微升待检的标本（血清、血浆或其他的液体）混匀，室温静置 10 分钟。第二步加 500 微升的无水乙醇混匀， 8000 转离心 1 分钟。第三步是层析柱过滤，将加过乙醇的标本加到层析柱，通过 8000 转离心 1 分钟，滤掉多余液体，核酸即可在层析柱上吸附，然后用洗涤液 A 和 B 洗脱柱上的盐和蛋白质， 13000 转高速离心 2 分钟，将层析柱和层析膜上多余的物质离下去，在层析柱的中间加 50 微升的洗脱液，室温静置 10 分钟，让它彻底溶在水中， 10000 转离心 3 分钟，洗脱液即可进行
7、 PCR 扩增。 2 、注意事项 第一步核酸裂解液含有异硫氰酸胍或盐酸胍，胍盐是裂解核酸的物质，它在低温时容易结晶、凝集，结晶后如果不能彻底溶化，只是取上清液和带液标本提取核酸，容易出现假阴性。通常的做法是在 56 度的环境让核酸裂解液彻底溶化，以肉眼看不到结晶为标准。另外是在室温静置 10 分钟，有的试剂盒是在 72 度放置 10 分钟。目前的核酸裂解液对病毒的裂解效果非常强，二者混匀之后，标本中的核酸基本上在 1 到 2 分钟均能够彻底裂解，放置的时间延长对病毒裂解效果不再有意义，反而对标本中的 RNA 起到降解作用。因此建议不同的实验室应摸索最佳条件。第三步是过层析柱，滤过后的液体，再进
8、行一次过滤，发现层析柱过滤的东西含有近一半核酸，包括洗涤液 A 、洗涤液 B 洗涤下来的液体。第四步加 50 微升洗脱液尤为关键，洗脱液一定要加在层析柱的中间，让它把层析膜完全浸泡，如果加在层析柱的壁上，而洗脱液没有和承袭膜上的核酸进行接触，洗脱液不可能完全洗脱。每一个洗脱液均含有一定量的核酸，并且每次的丢失量几乎在一半左右。 3 、优缺点 此方法的优点是可有效的去除标本中的 PCR 干扰物质，如胆红素、血脂、离子、蛋白、 RNA 酶等，提取的 RNA 的稳定性比较好。缺点是核酸丢失比较严重，过滤丢失有 50% 左右，洗脱又接近 50% 。另外环境因素影响较大，如裂解液必须彻底的复溶，不能存在
9、结晶、凝集，离心、操作、不同的实验室人员和仪器等的差异。 （三）磁珠法 1 、操作步骤 磁珠法为新兴的方法。磁珠可以和磁吸附，因此可以省去离心过程，也有试剂仍采用离心的方法。以某公司试剂盒的 HCV 磁珠法为例做介绍：第一步，取 100 微升已经配置好、含有磁珠的核酸裂解液，与 100 微升的待检标本（血清、血浆或者其他的体液），充分混匀，室温静置 10 分钟，然后 8000 转离心 2 分钟，让含有结合核酸的磁珠沉淀，去掉上清液。第二步，加洗涤液 A 和洗涤液 B ，分别用 8000 转洗涤 2 分钟，离心 2 分钟，去掉上清液。最后一步有两种做法，一种是把 PCR 反应液直接加在含有磁珠的
10、试管里，把磁珠溶开，然后直接放置于 PCR 扩增管里；第二种是把磁珠加洗脱液，将磁珠上的核酸洗脱下来，取上清液进行 PCR 扩增。 2 、优缺点 此方法的优点也是可有效去除 PCR 干扰物质，其缺点为：磁珠弃上清和洗涤两次去上清，实验发现每次的上清都含有相应的核酸；磁珠对 PCR 扩增有影响，洗脱的核酸丢失。如果把磁珠上的核酸洗脱下来，会产生洗脱不彻底的情况，洗脱应尽可能在 37 度到 50 度的环境进行，洗脱下来的核酸量较少。目前罗氏公司新出的 MQ 磁珠法提取核酸，洗脱时的环境温度为 50 度。 （四）血清直接法 1 、操作步骤 血清直接法是近年新出现的方法，目前市面上已有两种方法。一种可
11、称为 A 法：取 5 微升的核酸裂解液和 5 微升的待检标本（待检标本主要是血清、血浆或血细胞和其他体液，尿液或粪便不能用这种方法），二者混匀后直接加入 PCR 反应液。第二种方法可称为 B 法：取 3 l 核酸裂解液，与 3 l待检标本（血清、血浆），混匀， 95 处理 10 分钟，直接加入 PCR 反应液， 13000RPM 离心 1 分钟直接进行 PCR 扩增。高温处理 10 分钟可以把标本中的蛋白沉淀、凝固，沉淀核酸吸出。和 A 法不同的是它把蛋白做了沉淀凝固，相应的减少了 PCR 干扰物质。 2 、优缺点 此方法最重要的优点是没有核酸的丢失，定量标准。 B 法经过高温处理后使蛋白发生
12、了变形，在很大程度上消除了标本中的干扰物质。缺点是无法消除标本中 PCR 干扰物质带来的干扰。 A 法目前在国内已获得 SDA 批文，通过临床检测也发现对临床常规的大部分标本影响不是很大，但是对病毒核酸比较低的标本影响还是相对较大。 （五） COBAS TaqMan 全自动核酸提取与扩增系统 最后一个方法是 COBAS TaqMan 全自动核酸提取与扩增系统，为新进入国内的方法，为 全自动化设计的病毒载量平台，具有 sample-in, result-out 的特点；内部标准品方法定量，保障结果的准确度和精密度；实验进行中即可添加耗材、样本及试剂，软件可显示所有内容的进行状态；所有样本 , 试
13、剂及耗材采用条码自动扫描设计 , 方便实验记录及追踪；整个试验流程应最大程度避免污染问题 。分两部分，第一部分是核酸提取系统，第二部分是扩增系统。其特点为核酸提取是全封闭的，一般需要 2 到 3 个小时，可以处理 24 或 48 个标本，处理完以后直接把加好的 PCR 扩增管移到扩增仪器里，扩增仪器有两个扩增装置，可以单独运行。 目前主要用于乙肝、丙肝、艾滋病毒的检测。对乙肝的检测范围，敏感性可以达到 12 个 IU 每毫升，线性范围是 54 到 1.1 18。目前临床标本病人的血清病毒的含量均超过了108 ，因此不建议用此方法检测病毒含量超过 1.1 108的标本。 对丙肝低限可以达到 15
14、 个 IU ，线性范围是 43 到 6.9 107。临床研究发现，目前丙肝病人血清或血浆中 HCV RNA 的含量基本上都涵盖在此范围之内，因此丙肝病人不需要做稀释和特殊选择， HIV 也是。 综上所述，把握核酸提取的细节，对检测的质量非常重要，因此操作人员的专业素质尤其重要。 三、仪器对荧光 PCR 检测结果的影响 与荧光定量有关的环境因素，对于仪器包括三个部分，第一个热模块。热模块的原理不同，会导致温度均一性。目前 PCR 仪器的热模块主要包括半导体、空气和压缩机，空气加热相对比较稳定和快速，均一性相对较好。第二个是光学模块，即荧光的采集、照相部分。目前大部分仪器是采用 CCD 照相的原理
15、、 PMT 逐行扫描和光栅的逐孔，其中 PMT 逐行扫描的均一性较好， CCD 照相的差异相对较明显。第三个是软件模块，一般的影响因素较小，但是有的软件可以有效捕捉到 PCR 扩增指数扩增的点和有效的放大倍数，此倍增的处理能够有效的反应扩增量的变化。因此软件模块对结果分析的简易程度也有一定影响。 不同的仪器的差异或同一个仪器均一性的实验常选择 5 点平均分布的方法。如 96 孔板，开在 96 孔板的 4 个角和中间，加上通往复孔的 3 到 4 份标本（同一个核酸含量），然后进行 PCR 扩增，看五个区域的结果是否能够在有效的的质控范围之内，即为 5 点平均分布。通过实验可发现不同的仪器甚至同类
16、型的仪器存在差异。因此在选择仪器时要考虑究竟是应用于科研还是临床常规检测，用于科研影响不是很大，但临床检验需对仪器间的差异做校准。 图 1 理想化的扩增曲线 图 1 为理想化的扩增曲线。不论标本中的核酸含量高低，都应该在按照相应指数扩增速度向上扩增，温控、光学、软件模块都应该达到同样的标准和理论值，和实体一致。 理论值和实体值要一致，才能达到比较标准的结果。 图 2 扩增图 图 3 标准曲线 图 4 中高拷贝的和低拷贝的平行，它的扩增效果和倍增均一致。图 5 有线的交叉，即存在孔间和扩增效率的不一致，对定性实验影响不大，但对定量实验会产生一定影响。 图 4 平行曲线 图 5 交叉曲线 四、内标与内标定量对荧光定量的影响 （一）实时荧光定量 PCR
