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1、.,实时荧光定量PCR对丙肝RNA检测的影响因素,.,丙肝RNA检测影响因素,实验室条件影响因素 标本影响因素 核酸提取及反转录过程的影响因素,.,实验室条件影响因素,实验室设置 实验室设施设备 实验室工作人员,.,实验室条件 实验室设置,根据卫生部颁发的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法(卫医发200210号)规定“临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区，如使用全自动分析仪，区域可适当合并。”,.,实验室条件 实验室设施设备,各实验区域应有专用的仪器设备，同一区域内的仪器设备、物品和工作服应有明显标记，避免
2、与其他区域的仪器设备混用。,.,实验室条件 实验室工作人员,应具备良好的分子生物学专业技术操作规范。 方向：试剂贮存和准备区核酸制备区扩增区扩增产物分析区,.,标本影响因素,抗凝剂 溶血 脂血 标本的保存,.,标本影响因素 抗凝剂,用于丙肝RNA测定最好使用EDTA抗凝全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除。如使用血清标本，则需尽快（2小时内）分离血清。,.,标本影响因素 溶血,由于溶血标本中存在的血红蛋白可以抑制Taq酶的活性，致使定量结果偏低，甚至出现假阴性结果。虽然目前大多数荧光定量PCR试剂盒使用核酸提取柱提取RNA,该方
3、法操作简便快速，有实验表明，即使存在高浓度血红蛋白等干扰物质在用柱抽提的过程中被完全去除，为模板的核酸得到了高度纯化，从而可以避免样本溶血对实验结果的影响。但是血细胞破裂会有大量核糖核酸酶（RNsae）释放而使提取模版的RNA降解，这必然导致定量结果降低，因此被检样品决不能溶血。,.,标本影响因素 脂血,未经处理的脂血标本在加样过程中因脂肪颗粒占有一定体积 而引起血清加样量相对减少 。 脂肪或其代谢产物也能与Taq酶相互作用，抑制Taq酶的活性，扩增效率明显降低，导致检测结果降低。 有研究表明：在较高水平的病毒载量的标本中 ，扩增效率与HCV-RNA定量检测水平不发生明显的数量级改变，而在低水
4、平的病毒载量的标本中，脂血标本对检测结果有明显的干扰作用。,.,标本影响因素 标本的保存,由于RNA为单链，极不稳定，且易被RNase所降解，因此应在取血后尽快提取RNA，如不能做到，则需要分离出血浆或血清进行冷冻保存，短期（1-2周）保存可在-20oC下，较长期保存应在-70oC。有研究表明，-20oC存放 7个半月后临界标本完全降解而其他标本结果稍有下降，因此标本不宜保存太长时间。,.,核酸提取及反转录 过程的影响因素,核酸提取又称标本处理，这一阶段人为因素影响最大，因此要求需由具有专门经验和经过培训的人员进行操作，操作人员应穿工作服，戴一次性手套并经常替换。,.,核酸提取及反转录 过程的
5、影响因素,由于RNA病毒检测较一般DNA病毒检测复杂，在裂解HCV颗粒，提取RNA，沉淀RNA，反转录中均有很多影响结果因素需要注意，其中最重要的是防止RNase污染和提取不充分。,.,核酸提取及反转录 过程的影响因素,核酸提取过程中经常需要离心操作，离心最好使用低温高速离心机，离心速度和时间一定要按要求，否则可能造成RNA提取不完全，而使定量结果降低，甚至出现假阴性。,.,总之，实时荧光定量PCR检测HCV-RNA的影响因素非常多，比如不同核酸提取方法对同一临床标本HCV-RNA核酸提取效率差异也很大。有研究指出，简化了的酸性异硫氰酸胍一酚一氯仿RNA提取方法表现出提取效率低和重复性差，不适宜应用于HCV-RNA定量试验，磁性硅胶分离技术法和柱式离心分离技术法都显示了较高的HCV-RNA提取效率和收获RNA的质量，以及定量试验中较好的方法性能。所以在实际工作过程中除了需要注意以上几点外还需要不断学习新的知识和技术，采用先进的检验方法，而且从原始标本的采集到出具检验报告的各个环节都尽量做到规范操作，认真做好室内质控积极参加室间质评，保证检验结果的准确。,
