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1、Chapter5 病毒的遗传分析GeneticAnalysisofVirus 1 病毒 virus 既不同于原核生物 也不居于真核生物 因为它们没有一般的细胞结构 在病毒中没有合成蛋白质外壳所必需的核糖体 所以只能寄生在动物 植物和细菌的细胞内繁殖 它能使宿主细胞的机构转而合成它自身新的病毒物质 尽管病毒能形成晶体 自身不能进行代谢等 但仍将病毒视为生物 因为它们能够繁殖 病毒离开宿主细胞虽然不能繁殖 但仍可以存活 根据宿主细胞的不同而将病毒分为动物病毒 植物病毒和细菌茵病毒3种 细菌病毒又称噬茵体 phage 2 根据宿主不同 可以分为 动物病毒植物病毒细菌病毒 噬菌体 bacterioph
2、age phage 3 4 冠状病毒 5 SARS病毒为单链 RNA病毒 全长29 725kb 具有11个ORF OpenReadingFrames 分别编码 依赖于RNA的RNA聚合酶 4种结构蛋白 S E M N蛋白 5种未知蛋白 图5 与其它宿主来源冠状病毒的序列比较 进化分析 呈一单独的分支 病毒在增殖过程中虽没有逆转录过程 但RNA聚合酶没有矫正机制 变异较大 SARS的变种很多 6 PhageT4 研究最为广泛的是T噬菌体 7 Viruses non livingparticles reproduceonlywithinahostVirushasproteincoat nuclei
3、cacidcore ssDNA dsDNA ssRNA dsRNA maybelinearorcircularmoleculeViralgenomeintegratedintohostgenomeorseparate 病毒的一般特性 8 病毒在遗传学研究中的优越性 1 繁殖快 世代短 病毒一小时可繁殖百个 2 易于培养化学分析 一个试管可装很多 易于获得大的数量用于分析 3 遗传物质简单 只含裸露DNA或RNA 适用基因结构和功能研究 4 便于研究基因突变 5 便于研究基因的作用 6 可用作研究高等生物的简单模型 9 第一节噬菌体的繁殖和突变型 一 噬菌体的形态结构 1 噬菌体的形态 1 20
4、面体 无尾 PM 2 2 20面体 有尾 SPO1 3 丝状 M13 10 2 几种噬菌体的染色体特点 11 12 3 T4噬菌体的结构 13 14 二 噬菌体的生活周期 1 噬菌体吸附到宿主细胞上 2 尾丝鞘收缩 中轴刺穿宿主细胞 3 头部的DNA被送入宿主细胞 4 在数分钟内 所有的细菌核酸和蛋白质合成都被抑制 15 5 噬菌体大分子合成 细菌的核酸被降解 16 1 噬菌体DNA复制 2 噬菌体外壳蛋白合成 17 1 DNA被包到头部 2 组装尾部 3 装上尾丝 6 噬菌体组装 18 约200个噬菌体导致细菌被噬菌体基因编码的溶菌酶 lysozyme 溶解 7 宿主细胞破裂 19 二 噬菌
5、体的繁殖 1951年 J Lederberg的妻子Estherlederberg证明了Lederberg和Tatum使用的K12E coli中含有原噬菌体 并命名为 10年后终于搞清了溶源化的实质 20 二 噬菌体的繁殖 1 烈性噬菌体 virulentphages 概念 感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳 重新组装成噬菌体颗粒 并导致细菌细胞解体 释放出噬菌体 繁殖 吸附在特异的受体上 酶 细胞壁形成微孔 注入核酸 停止细菌的代谢 合成phage的成分 裂解 释放 21 烈性噬菌体溶菌 22 2 温和噬菌体 temperatephage 温和噬菌体感染细菌后 将自己的DNA整合到细菌
6、的染色体DNA中 形成原噬菌体 prophage 这一过程称为溶源化 lysogenization 整合到细菌染色体的噬菌体DNA随细菌的染色体复制而复制 经过若干世代后才从寄主的染色体上脱离下来复制和合成噬菌体蛋白 组装成新的噬菌体 并导致菌体细胞裂解 23 温和型噬菌体 temperatephage 具有裂解和溶源两种途径 1 裂解途径 和烈性噬菌体相同 24 温和噬菌体溶源 25 2 溶源途径 溶源周期经诱导进入裂解周期 26 噬菌体的生活史 27 噬菌体 噬菌体侵入后 细菌不裂解 附在E coli染色体上的gal和bio位点间的att 座位上 通过交换整合到细菌染色体 并能阻止其它 噬
7、菌体的超数感染 28 P1噬菌体 不整合到细菌的染色体上 而是独立存在于细胞质内 原噬菌体 整合到宿主基因组中的噬菌体 仅少数基因活动 表达出阻碍物关闭其它基因 原噬菌体经诱导可转变为烈性噬菌体裂解途径 29 P1和 噬菌体的生活周期特性 30 3 溶源性 有些细菌带有某种噬菌体 但并不立即导致溶菌 这种现象称为溶源性 具有溶源性的细菌称为溶源性细菌 lysogenicbacteria 受温和噬菌体感染的细菌 几乎都成为溶源菌 在细菌中处于潜伏状态的噬菌体称为原噬菌体 prophage 或原病毒 provirus 带有原噬菌体的细菌称溶源性细菌 lysogenicbacterium 失去原噬菌
8、体的细菌和为非溶源性细菌 non lysogenicbacterium 溶源性细菌有两个重要特性 1 免疫性 原噬菌体产生一种阴遏蛋白 抑制同类噬菌体DNA的复制 因而能抵抗同类噬菌体的超感染 2 可诱导性 自发 万分之一 紫外线或丝裂霉素90 31 三 噬菌体的突变型 噬菌斑 plaque 由于噬菌体的侵染 使细菌细胞裂解 有菌落上出现的一些园形而清亮的小洞 1 快速溶菌突变体 1 野生型r 形成小的噬菌斑1mm 周边有朦胧的光环 原因 有两个以上的噬菌体侵染一个细菌时 出现溶菌阻碍现象 混有裂解和未裂解的细胞 2 快速溶菌突变体r rapidlysis 形成大的噬菌斑2mm 边缘清晰 原因
9、 无溶菌阻碍现象 3 鉴别 噬菌斑大小 32 2 寄主范围突变体 1 野生型h 能感染野生型的大肠杆菌Ttos 但不能感染Ttor 2 突变型h对Ttos和Ttor都能感染 3 鉴别 混合Ttor和Ttos 野生型h 出现混浊噬菌斑 突变型出现清亮噬菌斑 4 噬菌体与细菌的关系 侵染与抗性 部分溶菌 33 3 条件致死突变体 所谓条件致死突变型 就是在某些条件下 这些突变型是致死的 那么这些条件就称为限制条件 restrictivecondition 而在另一些条件下仍可进行繁殖 从而得以扩增进行研究 所以这些条件称为许可条件 permissivecondition 常用的有两大类条件致死突变
10、 1 温度敏感 突变 temperaturesensitivemutation 2 抑制因子敏感 突变 suppressor sensitivemutation sus 34 1 温度敏感 突变 temperaturesensitivemutation 野生型噬茵体能在很大的温度范围内感染宿主并进行繁殖 热敏感突变型 heatsensitivemutants ts 通常在30 许可条件 感染宿主进行繁殖 但在40一42 限制条件 条件下就是致死的 不能形成噬菌斑 冷敏感突变型 coldsensitivemutation cs 在较低温度下就是致死的 原因 温度敏感性几乎总是一种突变的结果 基因
11、突变后所编码的蛋白质中有一个氨基酸的替换 而这种蛋白质在 限制温度 下不稳定而丧失活性 35 2 抑制因子敏感 突变 suppressor sensitivemutation sus 实质是原来正常的密码子变成了终止密码子 因而翻译提前终止 不能形成完整肽链而产生有活性的蛋白质 属于无义突变 nonsencemautation 带有sus突变的噬菌体在感染一种带有抑制基因 suppressor su 许可条件 的宿主菌时能产生子代 但在感染另一种没有抑制基因 su 限制条件 的宿主菌时 不能产生子代 野生型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代 sus突变不像 宿主范围突变 那样影响噬菌体对宿主的吸
12、附 这种突变的噬菌体能正常地吸附 注入自身的DNA 杀死宿主细胞 但不产生子代 36 1 抑制因子敏感突变的概念 例如 噬菌体mRNA基因细菌tRNA基因反密码子正常突变突变正常基因 5 TAC3 5 TAG3 3 ATC5 3 ATG5 mRNA5 UAC3 5 UAG3 3 AUC5 3 AUG5 表型 酪氨酸终止5 UAG3 酪氨酸 酪氨酸 3 AUC5 酪氨酸 37 表5 2携带不同专一性抑制基因宿主中sus突变噬菌体的表现 2 噬菌体的抑制因子敏感突变型类型及表现琥珀型 amber UAG赭石型 ocher UAA乳白型 opal UGA 38 sus突变分为三类 无义抑制基因 su
13、 实质 tRNA基因发生了突变 例如琥珀型抑制基因 su3 在UAG密码于上插入了一个酪氨酸 这是因为tRNA加基因的反密码子的一个突变 tRNATry 正常的反密码于是GUA 它按摆动规则译读酪氨酸密码子UAU C su3 菌株的tRNATry含有反密码子CUA 它识读琥珀型密码子UAG 并插入酪氨酸而防止终止 39 二 无义突变与无义抑制突变 无义突变 指一个为氨基酸编码的密码变为终止密码的突变 无义抑制突变 指能抑制无义突变表现的突变 40 四 噬菌斑分析 Theplaqueassay 1 噬菌斑 plaque 噬菌体感染固体培养基上的菌苔 lawn 溶菌后形成的圆形清亮的斑 41 Op
14、aquelawnofbacteria Clearareasofplaque 42 2 噬菌体浓度的测定方法 1 逐步稀释原溶菌液 10 1 10 3 10 5 10 7 2 感染平板培养基上的细菌菌苔 lawn 3 计数形成的噬菌斑 4 计算原溶菌液中的噬菌体数目 公式 噬菌斑数 mL 稀释倍数 原始噬菌体浓度 43 23 105 10ml 原始浓度 phages ml 44 噬菌体感染E coli 45 第二节噬菌体突变型的重组实验 一 T2突变型的两点测交 但10年未引起重视 1 1936年F M Burnet发现了噬菌体能产生突变体 形成的噬菌斑的外形与野生型噬菌体的噬菌斑有明显的区别
15、46 2 Hershey和Luria的发现 1946年第11届冷泉港会议上Hershey和Luria宣布发现噬菌体r h突变 Delbruck和Hershey发表了噬菌体重组 三人获1969年Nobelprize 生理或医学 47 噬菌斑的形态 宿主范围 h 噬菌体能在E coliB和B 2品系上生长 h 只能在E coliB品系上生长 3 Hershey使用两个表型特征 能在B和B 2混合菌苔上产生透明斑 能在B和B 2混合菌苔上产生半透明斑 r 快速溶菌 噬菌斑大 边缘清楚 噬菌斑小 边缘模糊 r 48 噬菌斑与基因型 B和B 2混合菌苔 49 4 噬菌体杂交 亲本噬菌体 T2 基因型 h
16、r 透明 小斑 边缘模糊 h r 半透明 大斑 边缘清楚 杂交过程 混合感染实验 两个亲本噬菌体混合感染E coliB和B 2 观察菌苔上出现的噬菌斑特征 推断噬菌体的基因型 mixedinfectionexperiments 50 混合感染 mixedinfection E coliB或B 2 T2phage 51 5 杂交结果 在B和B 2混合菌苔上出现了4种噬菌斑 52 半大 半小 透小 透大 53 6 重组机理 h r h r h r hr hr hr h r h r h r hr hr hr 噬菌体染色体在细菌体内复制 不同的噬菌体染色体在细菌体内交换重组 h r h r 54 h r h r h r hr hr hr h r h r h r hr hr h r 释放出的4种子代噬菌体 部分噬菌体DNA重组 55 7 噬菌体重组值与基因作图 重组值的计算 重组噬菌体的噬菌斑数 总噬菌斑数 100 基因图距 用两个基因的重组值表示基因间的遗传距离 h r hr totalplaques 100 56 Hershey和Rotman1949年的T2杂交结果 r h 24 57 8
