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1、 多克隆抗体制备 多克隆抗体的制备方法 动物选择 一 选择制备多克隆抗体 抗血清 的动物种类应考虑的要点 需要制备的抗血清的质量 供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种系关系 免疫动物产生的抗体特性 针对不同性质的免疫原选用相应的动物 二 动物的年龄 性别和数量对抗体制备的影响优先选取青壮年动物 雌性动物的免疫应答状况 无论是细胞性还是体液性免疫都比雄性个体强烈 家兔 家兔是最适合制备抗体的动物 其体型适中 成年体重为2 6kg 一次采血量可达25 50ml 全放血量则达100 180ml 性格驯顺 易于操作和采血 寿命相对较长 为5 8年 能生产足够量的高效价和高亲和力的抗血清 通常适用于制
2、备抗啮齿类和人蛋白质的抗体 家兔仅一型IgG而无亚型 用家兔的IgG很容易制备Fc Fab和F ab 2等片段 鸡 鸡的种系距哺乳动物较远 用以制备抗哺乳动物蛋白质的抗体具有独特的优点 鸡的IgG常称IgY 其特点是不会激活哺乳动物的补体成分C1 也不会与细菌蛋白A或蛋白质G 哺乳动物的Fc受体或类风湿因子等发生反应 在极端条件下 鸡IgY的稳定性不如家兔IgG 不过 鸡的IgY在鸡蛋内可保持稳定达数月之久 纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件下则可保存数年之久 用鸡IgY已经制备出Fc和单价的Fab或Fab 等片段 鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中 从鸡蛋中收获抗体可避免采用损伤性的收集手段 免疫
3、剂量 剂量 免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱 分子量大小和免疫时间 大动物抗原剂量 以蛋白抗原为准 约0 5 1mg 只 小动物约0 1 0 6mg 只 如无免疫佐剂可适当提高免疫剂量 10 20倍 乳化 一般抗原与免疫佐剂体积比1 1混合 首次免疫采用完全佐剂 加强免疫采用不完全佐剂 1 延长抗原释放时间 2 增加抗原的表面积 3 佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理 4 增强辅助T细胞的作用 5 刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体 使无免疫原性物质变成有效的免疫原 6 改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应 并使其增强 免疫方式 注射途径 免疫注射的途径也很重要 一般采用多点注射 一只
4、动物注射总数约为8 10点 包括足掌及肘窝淋巴结周围 背部两侧 颌下 耳后等处皮内或皮下 皮内易引起细胞免疫反应 对提高抗体效价有利 免疫方式 间隔与免疫时间 第一次免疫后 因动物机体正处于识别抗原和b细胞增殖阶段 如很快接着第二次注入抗原 极易造成免疫抑制 一般以间隔10 20天为好 二次以后每次的间隔一般为7 10天 不能太长 以防刺激变弱 抗体效价不高 免疫次数 根据抗体效价要求确定 抗血清滴度测定 免疫应答 机体免疫系统受到抗原刺激后 免疫细胞发生一系列变化 并产生一定免疫效应的过程 一 感应阶段 inductivestage 称致敏阶段 sensitizationstage 是抗原物
5、质进入体内 抗原递呈细胞 APC 对其识别 捕获 加工处理和递呈 以及抗原特异性淋巴细胞 T细胞和B细胞 对抗原的识别阶段 二 增生分化阶段 proliferativeanddifferentiativestage 又称反应阶段 reactivestage 是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化 进行增殖与分化 以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程 T细胞增殖分化为淋巴母细胞 最终成为效应T细胞 或称致敏T细胞 并产生多种细胞因子 B细胞增殖分化为浆细胞 合成并分泌抗体 一部分T B淋巴细胞在分化过程中成为记忆细胞 Bm和Tm 在此阶段 有多种细胞间的协作和多种细胞因子的参加 三 效应阶段 ef
6、fectivestage 此阶段是由活化的效应细胞 CTL与TD或TDTH 和效应分子 抗体与细胞因子 发挥细胞免疫效应和体液免疫效应的过程 这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物 初次应答 primaryresponse 机体初次接受适量的抗原刺激后 引起体内抗体产生的过程称为初次应答 主要特点为 机体初次接触抗原后 需经一定的潜伏期血清中才能出现抗体 潜伏期的长短取决于抗原的性质 抗原进入机体的途径 所用的佐剂类型 受体情况等 潜伏期之后为抗体的对数上升期 抗体含量直线上升 然后为持续期 抗体产生和排出相对平衡 最后为下降期 初次应答最早产生的抗体为IgM 可在几天内达到高峰 然后开始
7、下降 接着才产生IgG IgG抗体产生的潜伏期比IgM长 如果抗原剂量少 可能仅产生IgM IgA产生最迟 而且含量少 初次应答产生的抗体总量较低 维持时间也短 通常以IgM为主 且抗体的平均亲和力较低 再次应答 secondaryresponse 机体再次接触相同的抗原时 体内产生抗体的过程称为再次应答或回忆应答 anamnesticresponse 主要特点为 潜伏期显著缩短 约为初次应答潜伏期的一半 抗体含量大幅度上升 比初次应答多几倍到几十倍 而且维持时间长 诱发再次应答所需的抗原剂量极小 再次应答产生的抗体主要为IgG 而IgM很少 抗体的平均亲和力高 如果再次应答间隔的时间越长 机体越倾向于只产生IgG 抗原物质如经消化道和呼吸道等粘膜途径进入机体 可诱导产生分泌型IgA 在粘膜表面发挥免疫效应 血液采集 多克隆抗体纯化 蛋白A亲和层析蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段相结合也可与某些IgM和IgA相结合抗原亲和纯化多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一种层析方式 基本思路是将抗原固定在一种基质上 然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体 然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体 最后再将抗体洗脱下来
